秸秆覆盖及沟垄作对旱作田土壤细菌多样性及马铃薯产量构成的影响

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　　摘要    以马铃薯品种定薯4号为材料，研究了不覆膜平作（FP）、黑色地膜覆盖沟垄作（FM）、玉米秸秆整秆覆盖沟垄作（S1M）及玉米秸秆粉粹覆盖沟垄作（S2M）等4种栽培耕作方式对旱作田土壤细菌多样性及马铃薯产量的影响。结果表明，相对于黑色塑料地膜覆盖及不覆盖平作，玉米秸秆覆盖沟垄作可以显著提高马铃薯根际土壤细菌群落多样性，降低土壤中变形菌门及芽单胞菌门，并提高放线菌门的相对丰度，利于马铃薯根际土壤中浮霉状菌属、节杆菌属、溶杆菌属及链霉菌属的富集，对农田状况具有积极贡献;沟垄作覆盖栽培可显著提高薯块产量及大、中薯百分率，显著降低小薯百分率。
　　关键词    马铃薯;秸秆还田;16S rDNA测序;土壤微生物群落;产量形成
　　中图分类号    S532        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）04-0053-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　马铃薯（Solanum tuberosum L.）作为世界最重要的粮食作物之一，对全球粮食安全至关重要[1]。由于马铃薯具备耐干旱、耐贫瘠且高产的特点，在我国北方旱区广泛推广种植[2]。但随着近年来耕地面积的紧缩及干旱、低温等环境因素的限制，该区域马铃薯产业发展受到了一定程度的制约[3]。应用更加高效适宜的栽培耕作技术，以实现提质增产的目标，已成为该区乃至全国马铃薯产业寻求突破性发展的必由之路[4]。沟垄耕作栽培是国内旱区最主要的农业高效栽培技术之一，可有效富集自然降水并提高作物产量[5]。沟垄作结合地面覆盖能进一步起到减少农田水分流失、提高作物水分利用效率的作用[6]。Qin等[4]认为，沟垄覆膜能显著提高旱地马铃薯产量及水分利用效率;谢军红等[7]在对旱作田玉米的研究上也取得了相似的结论，且认为覆膜以及沟垄作具有明显的叠加效应。目前，仅甘肃省沟垄覆膜玉米的栽植面积就已近90万hm2，随着沟垄覆膜在玉米上的推广，虽大幅提升了其产量，但也导致了秸秆的大量弃用、焚烧，引发了各界对资源浪费及环境污染的思考与担忧，秸秆还田再利用逐渐成为被关注的热点[8]。同时，传统塑料地膜的大量使用对土壤环境具有一系列的潜在危害，不利于农田可持续发展[9]。鉴于此，国内諸多学者开始了对秸秆还田方式的积极探索[10-11]，秸秆覆盖代替地膜覆盖成为其主要形式[12]。李  辉等[13]认为，秸秆带状覆盖保墒作用明显，利于马铃薯薯块的形成与膨大;陈玉章等[14]的研究认为，玉米秸秆覆盖能显著提高马铃薯产量及水分利用效率。
　　国外学者普遍认为根际土壤微生物对植物生长具有重要影响，并开展了大量关于土壤微生物与植物互作关系的研究[15-16]。有害土壤微生物通常是导致植物病害发生的主要原因[17];部分微生物则对植物生长有积极的影响[16]。同时，土壤微生物的多样性被当作衡量土壤状况优劣的重要指标[18]。细菌作为土壤微生物中最主要的类群，研究意义极大。而目前关于秸秆覆盖结合沟垄作对旱作田土壤细菌多样性及马铃薯产量构成影响的研究未见报道，故立项研究，以期探明旱作马铃薯田土壤细菌群落及马铃薯产量对该综合栽培模式的响应。
　　1    材料与方法
　　1.1    试验地概况
　　试验于2018年4—10月在甘肃省定西市农业科学研究院试验基地（北纬35°31′，东经104°38′）进行，该区属中温带半干旱偏旱区，年日照时数约2 480 h，太阳辐射593 kJ/cm2，海拔1 925 m，年平均气温6.6 ℃，年均无霜期为142 d。土壤类型为土质绵软且质地均匀的黄绵土，试验田基本养分状况见表1。
　　1.2    试验材料
　　供试马铃薯品种为定薯4号，该品种由定西市农业科学研究院选育，适宜试区栽培，属中晚熟品种[19]。
　　1.3    试验设计
　　试验根据耕作模式的不同共设4个处理，分别为不覆膜平作（FP）、黑色地膜覆盖沟垄作（FM）、玉米秸秆整秆覆盖沟垄作（S1M）及玉米秸秆粉粹覆盖沟垄作（S2M）（图1）。3次重复，采用随机区组设计，小区面积为44.275 m2（5.75 m×7.70 m），种植密度为49 950株/hm2。于2018年4月21日播种，10月1日采收，其间进行日常田间管理。将尿素280 kg/hm2、磷酸二铵190 kg/hm2、硫酸钾180 kg/hm2于播种前作基肥施入。
　　1.4    测定指标及方法
　　1.4.1    土壤采集及土样总DNA提取。利用五点法于盛花期（7月1日）采集马铃薯根际土壤，收集时先将根系外围土壤抖落，后收集根系裹挟土壤，土样采集完成后立即转入-80 ℃超低温冰箱内冻藏，用于土壤总DNA的提取。
　　选用美国Mobio公司的PowerSoil DNA Isolation kit试剂盒进行各处理土壤DNA提取，提取完成的DNA样品保存于-80 ℃冰箱。 　　1.4.2    16S rDNA基因扩增与测序。16S rDNA基因扩增使用的通用引物序列为515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′及907R：5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′。以25 μL体系进行PCR扩增反应，包含5 μL 5×reaction buffer、5 μL 5×GC buffer、2 μL dNTP（2.5 mmol/L）、1 μL上游引物（10 μmol/L）、15 μL下游引物（10 μmol/L）、2 μL DNA模板、8.75 μL ddH2O及0.25 μL QS DNA Polymeraseo。
　　PCR反应条件：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行25～30个循环，72 ℃延伸5 min后终止，10 ℃保存。每个样本进行3次重复，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测重复样本PCR扩增产物，利用2%琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测，以美国Axygen公司的凝胶回收试剂盒对目标片段切胶回收，浓度及特异性合格后委托广州基迪奥生物科技有限公司Illumina Miseq平台进行16S rDNA测序。
　　1.4.3    土壤细菌群落鉴定与Alpha多样性指数分析。采用滑动窗口法对FASTQ格式的双端序列逐一进行质量筛查，随后利用FLASH软件根据重叠碱基对通过质量初筛的双端序列进行配对连接。后根据各样本的Index信息将连接后的序列识别分配入对应样本，以得到所有样本的有效序列。使用QIIME软件识别并剔除疑问序列，调用USEARCH工具，检查嵌合体序列并剔除。后调用UCLUST序列比对工具，按97%相似度将获得的序列进行归并及获得OTU。利用Silva数据库对各OTU的代表序列进行分类地位鉴定。通过OTU划分和分类地位鉴定结果，获得各处理在门及属分类水平的具体组成。
　　于90%的最低测序深度水平下对OTU丰度矩阵中的全体样本，进行统一随机重抽样以校正测序深度引起的多样性差异。之后利用QIIME软件对各样本的Alpha多样性指数（Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数）进行计算。其中，Chao1和ACE指数侧重于样本的微生物群落丰富度，香浓指数Shannon和辛普森指数Simpson则综合体现群落丰富度及均匀度。
　　1.4.4    马铃薯产量与产量形成测定。收获期以小区单收计产并折算为公顷产量;每小区随机选取10株考种，对单株结薯数及大、中、小薯百分率进行统计。统计时，175 g以上薯块定义为大薯，50～175 g为中薯，50 g以下为小薯。
　　1.5    数据处理与统计分析
　　分别采用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0进行原始数据统计和分析，采用Adobe Illustrator CC 2018及Origin Pro 2018作图;利用LSD法（P<0.05）进行差异显著性分析。
　　2    结果与分析
　　2.1    土壤细菌Alpha多样性分析
　　借助土壤细菌稀疏曲线可以判断各样本的测序深度能否反映该样本细菌群落多样性。如图2所示，测序量达到12 000后各曲线均趋于平坦，认为该测序深度理想，可准确衡量各处理细菌多样性。相同测序深度下各处理OTU数目以FP最小，FM次之，S1M及S2M较大，秸秆覆盖沟垄作可能会增加土壤细菌群落的物种多样性及丰富度。
　　土壤微生物多样性是衡量土壤微生态群落稳定性的重要标尺。由表2可知，处理S1M、S2M的Chao1指数和ACE指数显著高于处理FM、FP，FM则显著高于FP;其中处理S2M的Chao1指数及ACE指数最高，分别比FP高42.8%及42.9%。说明玉米秸秆覆盖沟垄作及黑色地膜沟垄作均能显著提高马铃薯根际土壤细菌群落丰富度。处理S1M、S2M的辛普森指数和香浓指数无显著性差异，均显著高于处理FM、FP;处理S2M的辛普森指数最高，比处理FP高17.2%;香浓指数则以处理S1M最高，比处理FP高7.4%。这说明玉米秸秆覆盖沟垄作可以显著提高马铃薯根际土壤细菌群落多样性，黑色地膜沟垄作则对细菌群落多样性无显著性影响。
　　2.2    土壤细菌分类学组成和丰度分布
　　2.2.1    土壤细菌分类学门类组成和丰度分布。根据OTU划分结果，对12个样本门水平上的细菌种类及相对丰度进行了统计分析，所有样本的细菌种类共涵盖40个门类。如图3所示，各样本细菌群落中相对丰度在1%以上的门类共有7个，分别为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、浮霉菌门（Planctomycetes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）及拟杆菌门（Bacteroidetes），以变形菌门及放线菌门的相对丰度最高，分别为23.7%及20.5%;酸杆菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门及拟杆菌门依次占比15.1%、11.1%、9.7%、9.3%及5.3%;剩余33个门类相对丰度极小，总和为5.4%。覆盖及沟垄作对细菌门类组成及丰度具有一定影响，其中部分门类丰度变化明显，变形菌门相对丰度表现为FP>FM>S1M>S2M;放线菌门丰度表现为S2M>S1M>FM>FP;芽单胞菌门表现为FP>S1M>S2M>FM。可以看出，玉米秸秆覆盖及沟垄作可明显降低土壤中变形菌门及芽单胞菌门的相对丰度并对放线菌门有促进作用。
　　2.2.2    土壤细菌分类学属类组成和丰度分布。各处理共涵盖650个属，对相对丰度最大的20个进行统计分析。由图4可知，优势属（相对丰度0.5%以上）共有6个，依次为浮霉状菌属（Planctomyces，10.9%）、氨氧化菌属（Candidatus Nitrososp-haera，0.85%）、溶杆菌属（Lysobacter，0.82%）、节杆菌属（Ar-throbacter，0.74%）、链霉菌属（Streptomyces，0.70%）、甾类菌属（Steroidobacter，0.65%），其余菌属占比极低。部分优势菌属的丰度受秸秆覆盖及沟垄作的影响较大，其中浮霉状菌属及节杆菌属的相对丰度表现为S2M>S1M>FM>FP;溶杆菌属的丰度表现为S2M>S1M>FP>FM;链霉菌属为S1M>S2M>FM>FP。由此说明，黑色地膜溝垄作可能对浮霉状菌属、节杆菌属及链霉菌属具有促生作用，同时在一定程度上降低了溶杆菌属的丰度;秸秆覆盖沟垄作则更利于马铃薯根际土壤中浮霉状菌属、节杆菌属、溶杆菌属及链霉菌属的富集。 　　2.3    马铃薯产量构成性状
　　由表3可知，处理FM、S1M、S2M的大薯百分率及中薯百分率显著高于处理FP，小薯百分率显著低于处理FP;各处理单株结薯数无显著性差异;与处理FP相比，处理FM、S1M、S2M的马铃薯产量显著提高。由此说明，覆盖及沟垄作能显著提高旱作田马铃薯的大、中薯百分率，顯著降低小薯百分率，同时显著增产。处理FM、S1M、S2M分别增产33.0%、43.4%及44.3%，3种沟垄作制度之间秸秆覆盖增产幅度大于黑色地膜覆盖，但未达显著性水平。
　　3    结论与讨论
　　土壤微生物多样性用于衡量土壤微生态群落稳定性，通常与土壤状况优劣成正相关[18]。本研究表明，玉米秸秆覆盖沟垄作可以显著提高马铃薯根际土壤细菌群落多样性，而黑色地膜沟垄作则对细菌群落多样性无显著性影响。同时，2种玉米秸秆覆盖方式明显降低了土壤中变形菌门及芽单胞菌门的相对丰度并对放线菌门有促进作用。另外，黑色地膜沟垄作可能对浮霉状菌属、节杆菌属及链霉菌属具有促生作用，同时在一定程度上降低了溶杆菌属的丰度;秸秆覆盖沟垄作则更利于马铃薯根际土壤中浮霉状菌属、节杆菌属、溶杆菌属及链霉菌属的富集，该4种菌属为常见生防菌属，对农田状况具有积极贡献。国内学者[13-14]认为，秸秆带状覆盖及沟垄作可提高马铃薯产量。本试验在此基础上的研究证明，沟垄作覆盖栽培可显著提高薯块产量;此外，可显著提高大、中薯百分率，显著降低小薯百分率[20]。
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