基于高通量测序技术分析2种菌草根际土壤真菌群落多样性

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　　摘  要：為了解福州菌草基地巨菌草和绿洲一号2种菌草的根际土壤真菌群落多样性，采用Illumina Miseq高通量测序技术和生物信息学方法，对菌草根际土真菌的多样性及群落结构进行分析。结果表明：从3份土壤样本中获得525 292条ITS序列，在97%序列相似性基础上可划分为7267个可操作分类单元（OTU）。真菌群落的丰富度指数（ACE）以菌草非根际土最低，绿洲一号根际土略高于巨菌草根际土;而多样性指数（Shannon-Wiener和Simpson）菌草根际土高于非根际土，绿洲一号根际土略高于巨菌草根际土。3份样品的优势菌门为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）;优势菌纲为散囊菌纲（Eurotiomycetes）、粪壳菌纲（ Sordariomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、伞菌纲（Agaricomycetes）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、圆盘菌纲（Orbiliomycetes）、银耳纲（Tremellomycetes）、粘膜菌纲（Wallemiomycetes）;优势菌属为篮状菌属（Talaromyces）、深黄伞形霉属（Umbelopsis）、枝孢菌属（Cladosporium）、暗双孢菌属（Cordana）、镰刀菌属（Fusarium）、隐球菌属（Cryptococcus）、淡紫紫霉属（Purpureocillium）、赤霉菌属 （Gibberella）、灵芝属（Ganoderma）。研究结果表明，菌草根际土真菌群落多样性高于非根际土，为进一步更好地利用菌草提供理论参考依据。
　　关键词：菌草;根际土壤;真菌群落多样性;高通量测序
　　中图分类号： Q938      文献标识码：A
　　High-throughput Sequencing Analysis of Fungal Community in Rhizosphere Soils of Two Plants for Mushroon Cultivation （JUNCAO）
　　YE Wenyu1，2， XIE Xuze2， XU Yuying2， NI Mingyue3， HU Hongli3， YU Wenying 2， Norvienyeku Justice2，
　　LU Guodong1，3*
　　1. China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China ; 2. College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 3. College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
　　Abstract： High-throughput sequencing and bioinformatics analysis were used to analyze the composition of fungal communities in the rhizosphere and non-rhizosphere soils from the plants for mushroom cultivation. A total of 525 292 fungal ITS sequences from the samples were obtained. 7267 OTU （operational taxonomic units） could be grouped based on 97% sequence similarity as the threshold. The ACE of the fungal community was the lowest in the non-rhizosphere soil， and the rhizosphere soil of Lvzhou No. 1 was slightly higher than that in the rhizosphere soil of the plants for mushroom cultivation. The Shannon-wiener and Simpson values obtained for rhizosphere soils were higher than the values recorded from non-rhizosphere soils. Also， the Shannon-wiener and Simpson values for Lvzhou No. 1 rhizosphere soil was slightly higher compared to the values obtained for the rhizosphere soil of the plants for mushroom cultivation. This study further revealed Ascomycota， Basidiomycota， Zygomycota， Chytridiomycota， and Glomeromycota as the pre-dominant phylum present in all the rhizosphere soil samples. From class level analysis， we identified eight pre-dominant classes in all soil samples， including Eurotiomycetes， Sordariomycetes， Agaricomycetes， Leotiomycetes， Orbiliomycetes， Tremellomycetes， Dothideomycetes， and Wallemiomycetes. Nine pre-dominant genuses， including Talaromyces， Umbelopsis， Cladosporium， Cordana， Fusarium， Cryptococcus， Purpureocillium， Gibberella， and Ganoderma in all the soil samples were revealed. The results would provide insights into the prevailing upsurge in diversity in the rhizosphere fungi community compared to the non-rhizosphere soil and would serve as a reference for the characterization of rhizosphere fungi. 　　Keywords： plants for mushroom cultivation （JUNCAO）; rhizosphere soil; diversity of fungal communities; high- throughput sequencing
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.019
　　近年来，高通量测序技术[1-3]已成为分析土壤根际微生物多样性研究的方法之一[4-5]。巨菌草（Pennisetum giganteum）和绿洲一号（Arundo donax cv.Lvzhou No.1）均为禾本科（Gramineae）年生草本植物，国内（河南、内蒙古、西藏、陕西、青海、甘肃等地区）、国外（卢旺达、斐济、莱索托和南非等国）均有分布[6]。这2种菌草不仅可作为食用菌、药用菌的培养基[7]，还可作为动物饲料[8-9]、生物能源物质[10-11]及具有生态治理作用[12-16]。随着人们生活质量的提高、生态环境的改善及畜牧业的发展，迫切需要开展提高菌草产量和质量等方面的研究。
　　植物与根际土壤微生物的关系十分密切，根际土壤微生物种类和数量对植物营养养分循环[17]过程具有重要意义。根际土壤微生物影响植物根系的发育、促进植物的生长及抑制或减轻植物病害的发生等起一定的作用[18-20]，其多样性及其生态功能成为目前国内外的研究热点[21-22]。真菌是土壤微生物的主要组成部分之一，对植物的生长发育等方面有着重要的生物学功能，如防治植物病害[23-24]、促进植株生长[25]和增强植物抗逆性[26]等。国内外学者对植物根际土真菌群落多样性等方面进行了研究，常见的根际土真菌属有镰刀菌属（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）等[27];从白菜软腐病根部土壤分离出草茎点霉（Phoma herbarum F217-1）能拮抗细菌性软腐病[28]。
　　菌草作为具有广泛用途植物之一，其根际土壤真菌多样性的相关研究尚未见报道。为探讨同一生长条件下不同菌草根际土壤微生物群落多样性，以福建农林大学菌草基地的巨菌草和绿洲一号根际土壤为研究对象，采用Illumina Miseq高通量测序技术对真菌ITS3-ITS4区片段进行测序并进行生物信息学分析，从分子水平上揭示巨菌草和绿洲一号根际土壤真菌群落的多样性，以期为深入研究巨菌草和绿洲一号根际土壤真菌潜在的生态功能研究提供一定的理论参考。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　样品采自福建农林大学菌草试验基地根际土壤。采集时随机选取巨菌草和绿洲一号植株各5株，抖落根系外围土壤，收取附着于根系表面的土壤做为根际土，并同时采取其同一地块的巨菌草和绿洲一号共同对照非根际土壤。带回实验室立即放入80℃冰箱内备用。
　　1.2  方法
　　1.2.1  样品的采集  本研究将采自福建农林大学菌草基地菌草根系表面0～5 cm范围内10～20 cm土层的土壤视为根际土壤，而非根际土壤样品为距离菌草根系表面10～15 cm范围内10～20 cm土层的土壤。随机选取3个样点，多点采集的根际土和非根际土分别充分混合后，置于无菌自封袋中。将土壤样本带回实验室，置于?80 ℃冰箱中保存，备用。
　　1.2.2  土壤总DNA的提取  土壤DNA提取采用试剂盒（Fast DNA Spin Kit for Soil）（MP Biomedicals，USA），具体步骤参照提取说明书[29]。用1%的琼脂糖凝胶电泳（0.5×TAE）检测DNA的质量，质量合格的DNA于?20 ℃冰箱保存备用。
　　1.2.3  土壤真菌ITS序列的PCR扩增及高通量测序  以稀释后的土壤DNA为模板，采用真菌通用引物ITS3-2024F（5-GCATCGATG AAGA AC G CA GC-3）和ITS4-2409R（5-TCCTCCGCTTA T T G A TATGC-3）PCR扩增真菌ITS3-ITS4区域。PCR总反应体系为30 μL（Phusion Master Mix（2×）15 μL、Primer（2 μmol/L）3 μL（6 μmol/L）、DNA模板10 μL（5～10 ng）、H2O 2 μL）。反应程序：98 ℃预变性1 min;30 个循环包括（98 ℃，10 s;50 ℃，30 s;72 ℃，30 s）;72 ℃，5 min，3次重复。将同一样品PCR 产物混合后经电泳检测、割胶纯化、浓度检测等操作后，将样品送到诺禾致源生物有限公司，使用New England Biolabs 公司的NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测，合格后，使用HiSeq进行上机测序。
　　1.3  数据处理
　　对测序得到的原始数据（raw data）使用FLASH [30]对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据（raw tags）;拼接得到的Raw Tags，需要经过严格的过滤处理[31]得到高质量的Tags数据（clean tags）。然后用Qiime等[32]的Tags质量控制流程，经过处理后得到的Tags需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags序列通过（UCHIME algorithm）[33]与数据库（unite database）进行比对，检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列[34]，得到最终的有效数据（eff e ctive tags）。
　　利用Uparse软件[35]对所有样品的全部 Effective Tags进行聚类，默认以97%的一致性（identity）将序列聚类成为OTUs（operational taxonomic units），同时会选取OTUs的代表性序列进行物种注释，用QIIME软件中的blast方法[36] 与Unit数据库[37]进行物种注释分析，并分别在门（phylum）、纲（class）、属（genus）分类水平统计各样本的群落组成。使用MUSCLE[38]软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后以样品中数据量最少的为标准对各样品的数据进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。 　　使用QIIME软件计算Observed-species、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage，使用R软件绘制稀释曲线、Rank abundance曲线;使用R软件绘制PCoA图。
　　2  结果与分析
　　2.1  测序数据处理与分析
　　质量通过Illumina MiSeq高通量测序，9份土壤样品质控后得到了 525 292条有效序列，经过过滤和去除嵌合体之后得到了511 816条优质序列，优质序列的长度集中在200～450 bp之间，以97%相似度划分，共得到7267个OTU。
　　2.2  Chao1指数稀释曲线和Observed species指数稀释曲线
　　Chao1指数稀释曲线和Observed species指数稀释曲线可以判断样品测序量是否足够以及得知样品中群落的丰富度。从Chao1指数稀释曲线和Observed species指数稀释曲线来看，3个样品的稀释曲线均基本趋于平缓，说明测序量已足够覆盖样品中的所有物种（图1A和图1B）。在97%相似水平上计算各土壤样品测序的覆盖率，由表1可知，真菌文库测序覆盖率均在99%以上，说明取样合理，土壤样品间微生物文库测序覆盖率差异不显著。因此，测序数据能够真实地反映土壤样品中的微生物群落。
　　2.3  2种菌草土壤真菌群落结构变化
　　2.3.1  门水平群落结构分析  由图2可知，巨菌草根际土壤真菌群落在门类水平上主要类群为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌亚门（Basidio mycota）、接合菌門（Zygomycota）、壶菌门（Chy tridiomycota），相对丰度分别为59.51%、13.39%、1.26%、0.04%;绿洲一号根际土壤真菌群落在门类水平上主要类群为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌亚门（Basidio mycota）、接合菌门（Zygom ycota）、壶菌门（Chytridiomycota），相对丰度分别为64.37%、20.91%、0.83%、0.29%;对照非根际土壤真菌群落在门类水平上主要类群为子囊菌门（Ascom yco ta）、担子菌亚门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、壶菌门（Chytri diomyco ta），相对丰度分别为77.24%、7.02%、6.18%、0.05%。综上所述，菌草根际土和非根际土在门水平上丰富度最高的是子囊菌门（Ascomycota）。
　　2.3.2  纲水平群落结构分析  由图3可知，巨菌草根际土壤真菌群落在纲类水平上主要类群散囊菌纲（Eurotiomycetes）、座囊菌纲（Dothideo mycetes）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、伞菌纲（Agaricomycetes）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、银耳纲（Tremellomycetes），其相对丰度分别为2.72 %、2.75%、19.80%、12.03%、0.76%、0.67%;绿洲一号根际土壤真菌群落在纲类水平上主要类群散囊菌纲（Eurotiomycetes）、座囊菌纲（Dot hideomycetes）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、伞菌纲（Agaricomycetes）、锤舌菌纲（Leotio m ycetes）、银耳纲（Tremellomycetes），其相对丰度分别为9.51 %、15.51%、28.17%、16.97%、1.82%、2.61%;对照非根际土壤真菌群落在纲类水平上主要类群散囊菌纲（Eurotiomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、粪壳菌纲（Sordario myce tes）、伞菌纲（Agaricomycetes）、锤舌菌纲（Leotio mycetes）、银耳纲（Tremellomycetes），其相对丰度分别为55.44 %、4.67%、6.29%、2.10%、8.85%、3.95%。综上所述，菌草根际土和非根际土在纲水平上丰富度最高的是粪壳菌纲（Sordariomy cetes）。
　　2.3.3  属水平群落结构分析  由图4可知，巨菌草根际土壤真菌群落在属水平上主要类群为篮状菌属（Talaromyces）、深黄伞形霉属（Umbelopsis）、枝孢菌属（Cladosporium）、暗双孢菌属（Cordana）、镰刀菌属（Fusarium）、隐球菌属（Cryptococcus）、淡紫紫霉属（Purpureocillium）、 赤霉菌属（Gibberella）、灵芝属（Ganoderma），相对丰度分别为0.21%、0.62%、1.45%、1.21%、1.72%、0.38%、0.50%、0.10%、0.36%;绿洲一号根际土壤真菌群落在属水平上主要类群为篮状菌属（Talaromyces）、深黄伞形霉属（Umbelopsis）、枝孢菌属（Cladosporium）、暗双孢菌属（Cor dana）、镰刀菌属（Fusarium）、隐球菌属（Crypto coccus）、淡紫紫霉属（Purpureocillium）、赤霉菌属（Gibberella）、灵芝属（Ganoderma），相对丰度分别为0.77%、1.10%、5.58%、2.68%、3.74%、2.50%、3.05%、0.03%、0.96%;非根际土壤真菌群落在属水平上主要类群为篮状菌属（Talaro myces）、深黄伞形霉属（Umbelopsis）、枝孢菌属（Cladosporium）、暗双孢菌属（Cor da na）、镰刀菌属（Fusarium）、隐球菌属（Crypto coc cus）、淡紫紫霉属（Purpureocillium）、赤霉菌属（Gibbe rella）、灵芝属（Ganoderma），相对丰度分别为27.86%、5.20%、1.92%、0.16%、0.83%、3.73%、0.29%、0.23%、0.17%。综上所述，巨菌草根际土壤真菌群落在属水平上丰富度最高的类群为镰刀菌属（Fusarium），绿洲一号根际土壤真菌群落在属水平上丰富度最高的类群为枝孢菌属（Clados porium），而非根际土壤真菌群落在属水平上丰富度最高的类群为篮状菌属（Ta la ro myces）。 　　2.4  2种菌草真菌群落丰度和多样性分析
　　Shannon指数和Simpson指数用于反映土壤样品中微生物的多样性。由表1可知，与对照组相比，巨菌草和绿洲一号土壤真菌Shannon指数显著高于非根际土壤，Simpson指数显著低于非根际土壤;绿洲一号土壤样本的Shannon-Wiener指数高于巨菌草根际土壤，为6.6507，而Simpson指数低于巨菌草根际土壤，为0.0323。可见，巨菌草和绿洲一号根际土壤样本中土壤的真菌种群多样性高于非根际土壤。绿洲一号根际土壤样本
　　的真菌群落多样性略高于巨菌草根际土壤样本。
　　ACE指数和Chao1指数反映群落物种丰富度。由表1可知，与对照组相比，巨菌草和绿洲一号根际土壤真菌ACE指数、Chao1指数均比非根际土壤高，差异显著;绿洲一号根际土壤真菌ACE指数、Chao1指数均比比巨菌草根际土高，差异显著。结果表明，巨菌草和绿洲一号根际土壤样本中土壤的真菌丰度高于非根际土，绿洲一号根际土壤真菌丰富度高于巨菌草根际土。
　　2.5  2种菌草真菌群落的相关性分析
　　图5为巨菌草和绿洲一号根际土壤微生物的OTU韦恩图。由图5可知，对照、巨菌草及绿洲一号土壤样本中分别检测到真菌963、1261和1056个OTU，其中共有的OTU为597个，特有的OTU依次为191、112和288个，占对照、巨菌草及绿洲一号土壤样本中总OTU的8.09%、11.63%和22.84%。
　　2.6  基于OTUs的主坐标分析及样品间的NMDS分析
　　为了解不同菌草根际土壤微生物群落组成，对样本的土壤真菌群落进行主坐标分析（PCoA）。不同样本表现出分散或聚集的分布情况，结果如图6所示。图6A中绿洲一号与PC2轴相距均较近而与PC1相对较远，说明绿洲一号中真菌菌群结构受主成分PC2的影响大，PC2一种主成分对
　　样品中菌群结构的影响达到总影响因子的24.8%;巨菌草与PC1和PC2轴相距均较近，说明巨菌草中真菌菌群结构受主成分PC1和PC2的影响均大，PC1和PC2两种主成分对样品中菌群结构的影响分别达到总影响因子的58.91%和24.8%;对照与PC2轴相距较远，说明FSCK样品中真菌菌群结构受主成分PC2的影响不大。通过主坐标分析可见，真菌群落PC1和PC2可分别解释59.81%和24.8%差异性。绿洲一号、巨菌草及对照没有聚在一起，说明微生物群落差异大。
　　无度量多维标定法（Non-Metric Multi-Dimen sional Scaling， NMDS）统计是一种适用于生态学研究的排序方法。NMDS是非线性模型，其设计目的是为克服线性模型（包括PCA、 PCoA）的缺点，更好地反映生态学数据的非线性结构。应用NMDS分析，根据样本中包含的物种信息，以点的形式反映在多维空间上，而对不同样本间的差异程度，则是通过点与点间的距离体现，能够反映样本的组间和组内差异等。由（图6B）可知，3份样品中，代表绿洲一号（FSLV）的3个样品距离其他样品较远，表明该样品的真菌群落结构存在彼此之间差异较大。
　　3  讨论
　　巨菌草和绿洲一号是具有广泛作用的代表性菌草，在水土保持、荒漠化治理及提高落后国家人民的生活水平等方面具有重要的作用。植物根际土壤微生物参与土壤养分的转化和循环，可提高土壤肥力[39]。土壤微生物的种类和数量影响土壤养分的效能，进一步影响植物的生长。土壤健康的指标之一就是土壤微生物群落的组成及其多样性。
　　目前菌草根际土微生物多样性的研究还未见报导。菌草试验点选择在同一地点、管理一致的不同菌草，因此，巨菌草和绿洲一号根际真菌群落多样性的差异主要反映了不同菌草所产生的根际效应。高通量测序技术作为一种简单、快速、准确的免培养分子生物学技术，为认识土壤微生物多样性、群落结构组成及其生态功能提供有利手段[40]。本研究利用高通量测序技术分析了福州菌草基地的巨菌草和绿洲一号的根际土壤与非根际土壤真菌种群结构的多样性，为菌草根际微生物的研究奠定基础。菌草根际土壤样本的ACE和Shannon-iener指数值均大于非根际土壤样本，表明根际土壤真菌群落在丰富度和多样性上均高于其非根际土壤。绿洲一号根际土壤样本的ACE和Shannon- iener指数值大于巨菌草根际土壤样本，表明绿洲一号根际土壤真菌群落在丰富度和多样性上均高于巨菌草根际土壤。从门水平来看，3个样品的优势门为子囊菌门（Ascomycota），与一些学者的研究结果一致[41-44]。其说明子囊菌门（Asco my ota）真菌适应性广泛，在不同的土壤条件下都有分布。在属水平上，篮状菌属（Talaro myces）、深黄伞形霉属（Umbelopsis）、枝孢菌属（Clado s porium）、暗双孢菌属（Cordana）、镰刀菌属（Fusarium）、隐球菌属（Cryptococcus）、淡紫紫霉属（Purpureo illium）、赤霉菌属（Gibbe rella）、灵芝属（Ganoderma）是所有样品土壤真菌Top10 属中的共有属。姜华等[45]研究表明，芦苇根际土壤真菌的优势属有链格孢属（Altern aria）、青霉属（Penicillium）、拟青霉属（Paecilo myces）、木霉属（Trichoderma）和链格孢属（Alte rnaria）。这说明不同植物根际土壤优势真菌在属水平上是不同的[45]。
　　本研究结果表明，巨菌草和绿洲一号根际土真菌群落多样性与丰富度均高于非根际土。绿洲一号根际土真菌群落多样性与丰富度略高于巨菌草根際土真菌群落多样性与丰富度。
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