贮藏期蒜薹表面真菌群落组成分析

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　　摘要 蒜薹作为一种传统常年供应的蔬菜深受喜爱，由于贮存时间长，贮存过程中会有多种真菌产生，导致蒜薹失去经济价值。本文通过提取贮藏期蒜薹表面真菌的基因组DNA，经Illumina平台对7个样本的ITS扩增子进行测序，共获得2 418 016条raw reads，51个OTUs。通过OTU物种注释和物种丰度聚类，优势真菌属组成为：青霉菌属Penicillium 81.08 %，未知子囊菌15.13%，耐冷酵母Mrakia 1.74%，小球壳属Mycosphaerella 1.02 %。青霉菌是贮藏蒜薹后期表面的主要真菌。
　　关键词 贮藏蒜薹; 真菌; 扩增子测序; ITS; 多样性分析
　　中图分类号： S 436.33
　　文献标识码： A
　　DOI： 10.16688/j.zwbh.2018216
　　Abstract Garlic bolt is a kind of traditional vegetable in China. Due to long storage， the rot associated with fungi makes garlic bolts lose their economic value. In this study， the genomic DNA of seven samples of garlic bolts from cold storage was extracted， and the ITS region was amplified and sequenced on Illumina Miseq platform. A total of 2 418 016 raw reads and 51 OTUs were obtained. Through the OTU species annotation and species abundance clustering， the dominant fungal groups were Penicillium （81.08%）， unassigned ascomycete fungi （15.13%）， Mrakia （1.74%） and Mycosphaerella （1.02%）. It indicated that Penicillium was the major fungal group on the garlic bolts during the later stage of garlic bolt storage.
　　Key words garlic bolt; fungus; amplicon sequencing; ITS; diversity analysis
　　蒜薹是中国独有的蔬菜品种，是大蒜Allium sativum L.抽出的幼嫩花茎，由薹梗和薹苞组成。由于其鲜嫩可口，深受广大消费者青睐。据统计，2015年中国蒜薹年贮量约94.255万t，是国内外贮藏量最大的单一蔬菜品种[1]。受蒜薹低温休眠与春化栽培生理的局限，蒜薹生产通常只能秋播春收每年一季，采收后通过低温气调保鲜供应全年。但贮藏期蒜薹腐烂常导致许多贮藏库蒜薹损失高达30%～40%。明确贮存期间导致蒜薹腐烂的病原真菌种类迫在眉睫[2]。
　　扩增子测序就是通过PCR扩增，将目标区域DNA富集后进行高通量测序。对Internal transcribed spacer （ITS）区域进行测序，可以实现环境微生物中真菌多样性分析[3]。MiSeq测序系统采用边合成边测序的技术，每次运行最多能产生超过7 Gb的数据。目前采用MiSeq平台对ITS的测序，具有测序深度高、利于鉴定群落中低丰度物种以及费用低的特点，已成为研究真菌群落多样性的首选之策[4]。本文通过提取贮藏后期蒜薹表面真菌的基因组DNA，采用高通量测序的方法对ITS的扩增子进行测序，对贮藏后期蒜薹中真菌的群落组成及多样性进行了分析。
　　1 材料和方法
　　1.1 样品采集
　　贮藏蒜薹样品的采集地点为山东省济宁市金乡县鱼山镇亿客隆冷库，冷库容积为3 800 m3，贮藏温度控制在-0.4～-0.8℃，平均湿度控制在70%～80%，蒜薹贮藏方式为货架式，共19层，层间距为38 cm，蒜薹总储藏量为280 t。蒜薹来自济宁市金乡县及周边12个乡镇的蒜薹农业种植户，品种为‘金乡红薹’，入库时间为2017年5月3日～5月11日，每天蒜薹入库量为30～40 t，蒜薹梢朝外放置，由上至下、由内向外依次摆放于贮存架上，直至库满。蒜薹经过预降温后装入65 cm×110 cm的蒜薹专用硅窗袋中，每个硅窗袋存放19～20 kg蒜薹。2017年12月在此冷库东、西、南、北、中五点随机采样，鉴于冷库存储量巨大，又随机选取2份样品，共计7份，编号为A、B、C、D、E、F、G。每份样品的采集量为1 kg，保留完整的蒜薹整体（薹体和薹梢），0℃条件下保存，送样至上海天昊生物科技有限公司进行真菌群落组成分析。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 贮藏期蒜薹发病率调查
　　蒜薹在贮存过程中薹体霉烂就失去商品价值，所以对贮存蒜薹发病率的调查使用病梢率法。对A～G 7个采集样品的贮藏蒜薹随机抽取200根用于发病率的调查，每个样品3个重复，统计被侵染的蒜薹数量，计算发病率。
　　发病率=发病数量调查数量×100%。
　　调查数据用SPSS软件进行处理，用Duncan氏新復极差法进行差异显著性分析。
　　1.2.2 基因组DNA提取
　　蒜薹样品使用无菌水振荡洗脱表面微生物，洗脱液经离心，取沉淀进行DNA抽提，采用CTAB法提取基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至20 ng/μL[5]。 　　1.2.3 7个样本的ITS1区域扩增
　　对7个样本ITS1区域[3]进行高保真PCR扩增（MiSeq Reagent Kit v3，Illumina， USA），使用特异引物Primer F（Illumina adapter sequence 1+CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和Primer R（Illumina adapter sequence 2+GCTGCGTTCTTCATCGATGC），扩增体系以及扩增程序参照Mukherjee等[6]的方法。扩增体系为：樣本DNA（20 ng/μL）2.5 μL，Primer F（1 μmol/L）5 μL， Primer R（1 μmol/L） 5 μL，2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12.5 μL，共25 μL。扩增程序为：95℃ 预变性 3 min;95℃ 变性 30 s，55℃ 复性 30 s，72℃ 延伸 30 s，25个循环;72℃ 延伸 5 min。
　　每个扩增产物取5 μL 与带有Index 序列的引物（Nextera XT Index Kit， Illumina），通过高保真PCR 向文库末端引入特异性标签序列。扩增体系以及扩增程序参照Mukherjee等[6]的方法。体系为：Index Primer 15 μL，Index Primer 25 μL，PCR mix 25 μL，无菌水补足至50 μL。扩增程序为：95℃ 预变性 3 min;95℃ 变性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，8个循环;72℃ 延伸 5 min。PCR产物为样本的原始文库。
　　1.2.4 PCR产物混样与纯化
　　PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用试剂盒 （MiSeq Reagent Kit v3， Illumina， USA）回收目的条带。根据琼脂糖凝胶电泳的初步定量结果，对已经带有各自Index标签的样本文库进行3～5倍稀释，然后利用Qubit3.0对文库进行精确定量，根据不同样本的测序通量要求，按相应摩尔比例混合样本。
　　1.2.5 文库制备、库检与上机测序
　　混样后的文库通过生物分析仪（Agilent 2100 Bioanalyzer，USA）检测测序文库插入片段的大小，确认在120～200 bp 之间无非特异性扩增，并准确定量测序文库浓度。采用Miseq平台（上海昊天生物技术有限公司）2×250 bp的双端测序策略对文库进行测序。
　　1.3 数据分析方法
　　1.3.1 数据质控与统计
　　对原始下机数据进行质控和过滤：使用TrimGalore软件去除序列末端质量低于20的碱基并去除可能包含的adapter序列，之后去除长度小于100 bp的短序列;使用Flash软件（V1.2.7，http：∥ccb.jhu.edu/software/FLASH/）将双末端测序得到的成对序列进行拼接，得到merge序列，进一步去除merge后低质量序列（超过90%的碱基质量低于20）;使用Mothur软件（https：∥www.mothur.org/）查找并去除序列中的引物，删除包含N碱基/homopolymer超过6 bp的序列;使用usearch去除总碱基错误率大于2的序列以及长度小于100 bp的序列，得到质量和可信度较高的优化序列（clean reads），该数据将用于后续生物信息分析。
　　1.3.2 OTU聚类和物种注释
　　使用UPARSE软件（http：∥www.drive5.com/usearch/）去除singleton序列，以97%的相似性对序列进行聚类，相似度大于97%的序列将聚为同一个OTU（operational taxonomic units），同时使用denovo模式去除嵌合体序列，最终产生的OTU代表序列将用于后续物种注释。使用Mothur软件将每条OTU代表序列与Unit数据库进行比对完成OTU分类学注释，并分析各样本在分类水平统计中的群落组成。
　　1.3.3 真菌物种α多样性分析
　　采用Chao l、Shannon、Simpson、覆盖度等对蒜薹表面真菌OTU进行α多样性分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 冷库贮藏蒜薹发病率
　　对采集的样品进行发病率统计（表1），结果表明7个样本的发病率均在7%以上，E样品的发病率最高，为11.17%，统计结果表明7个样本之间的差异不显著（P>0.05）。
　　2.2 真菌ITS序列数据统计
　　A～G 7个样本经Illuminate Miseq平台高通量测序共得到2 418 016条clean reads，总碱基数585 923 487 bp，得到51个OTUs，拼接后的序列平均长度在249.80 bp。各样本的Raw reads、Merge、Primer 和Clean reads 统计如表2所示。
　　2.3 蒜薹样本真菌群落组成分析
　　使用R软件（MathSoft，USA）以UNITE数据库为参比，对Clean reads进行分类，样品中鉴定到的真菌分为2门8纲15目21科27属。子囊菌门真菌占比达到97.54%，而担子菌门真菌只占2.46%。对A～G 7个样本中平均占有率>1%的优势菌纲进行统计（表3），从大到小为散囊菌纲Eurotiomycetes（81.08%）、锤舌菌纲Leotiomycetes（15.21%），银耳纲Tremellomycetes（2.46%）和座囊菌纲Dothideomycetes（1.07%）。除Tremellomycetes纲，其他三个纲均为子囊菌门真菌Ascomycota。A～G 7个样品中，优势菌纲占有率稍有差异，但最优势菌纲均为Eurotiomycetes。 　　对A～G 7个样本中平均占有率>1%的优势菌属进行统计（表4），优势菌属有青霉属Penicillium、未知子囊菌、耐冷海洋嗜杀酵母Mrakia、小球壳属Mycosphaerella、低温酵母属Cystofilobasidium、假裸囊菌属Pseudogymnoascus和耐冷酵母属Guehomyces。A～G 7个样品中，Penicillium平均占比81.08%，E样本中占比最大，为94.48%，占比最少为C样本（61.60%）。酵母属真菌虽整体平均占比>1%，但不是所有样品中都有检出，Mrakia在样本A、C、E中未检出;Cystofilobasidium在样本G中未檢出;Guehomyces在样本A、C、E中未检出。表明子囊菌门真菌为贮藏蒜薹上普遍存在的真菌种类，而青霉属是最优势菌种。
　　对蒜薹表面真菌的OTU在属水平上进行了Heatmap展示（图1），各属在7个样品中分布存在差异。样品A和B、D和E的真菌群落组成相似度更高，被分别聚类到一个分支，而其他样品则单独聚为一支。7个样品的优势真菌均为青霉属真菌。
　　2.4 7个样品真菌物种α多样性分析
　　真菌的稀释曲线（图2）、香农指数曲线（图3）表明，随着序列条数的增加，曲线趋于平缓，表明测序数据量合理，基本覆盖样品中的类群。
　　3 讨论
　　蒜薹贮藏病害的已有研究主要涉及蒜薹表面致病菌的分离鉴定和生物学特征[78]，关于蒜薹表面真菌群落结构组成尚未见报道。本研究利用高通量DNA测序技术分析了山东济宁金乡冷库贮藏蒜薹样品的真菌多样性，结果共得到2 418 016条raw reads，51个OTUs。通过OTU物种注释和物种丰度聚类，最终得到主要的真菌组成为：子囊菌门和担子菌门;优势真菌属组成为： Penicillium、Mrakia、Mycosphaerella、Cystofilobasidium、Pseudogymnoascus、Guehomyces。不同样品蒜薹表面真菌组成相似，其中，以青霉属真菌占有率最高，酵母也有一定的占有率。
　　与以往报道相比，本研究中灰霉Botrytis cinerea和匍柄霉Stemphylium solani等主要致病菌并未大量检出。究其原因可能为：① 青霉属真菌的生物学特性适应贮存条件。青霉菌可以在0～50℃的范围内生长，并保持致病能力。赵淑艳等[7]的研究表明青霉菌对蒜薹有致病性，致病性略低于灰霉菌和匍柄霉菌。苏建红等[9]的研究表明在低温条件下青霉菌可侵染贮藏期洋葱，而且无伤也可侵染，可见低温条件下青霉依然保有侵染能力。7个样品的发病率无显著差异的结果也表明，占有率最高的青霉属是此次调查的贮藏蒜薹上的主要真菌类群。②青霉菌对防治药剂产生抗性。王金龙[10]对湖北省柑橘致病青霉进行咪鲜胺抗药性分析，发现78株指状青霉中有25株为抗性菌株，占比32%。而咪鲜胺是蒜薹冷库贮存的首选药剂。本试验中所采样本为生产中正常处理的样本，药剂熏蒸或药剂蘸梢等防治方式有效抑制了其他致病菌的发展，但对青霉菌的抑制效果不佳，也直接导致了贮藏蒜薹的发病率升高。
　　青霉属真菌是低温贮藏类果蔬的主要致病真菌，冬枣、柑橘、枸杞等水果的低温贮藏中均有发现青霉属真菌[1113]。青霉菌侵入果肉组织后，首先破坏了果实细胞壁的纤维素，进而将果实细胞的果胶质、蛋白质、淀粉、有机酸、糖类等分解为简单的物质，给酵母和细菌创造了生长的条件，使之得以大量繁殖。本研究中大量检出了耐冷酵母，与赵莹等[12]对贮藏后期的柑橘果实中分离到多种酵母的报道相一致。蒜薹经过微生物的侵染繁殖后，表面长出青灰色霉层，表皮组织变软、凹陷，并产生各种酸味、臭味，从而失去商品价值。
　　高通量测序方法可检测出培养法无法检出的难培养真菌，还确定了样品中大多数真菌的相对丰度，更直观地揭示了贮藏后期蒜薹表面真菌的群落组成，为下一步真菌的分离、鉴定及致病性测定提供了方向，也为防治药剂的筛选提供了理论基础。
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　　（责任编辑：田 喆）
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