云南榧树内生真菌的分离
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摘要：植物伴生的微生物是一个多样性十分丰富的微生物类群，而植物的内生真菌主要分布于没有外在感染症状的健康植物组织内。野生的榧树因其具有重要的药用价值而受到关注，本次研究以云南榧树为研究对象，对其内生真菌进行了分离和保藏，为药用相关活性物质的研究奠定基础。
关键词：云南榧树;内生真菌;分离;保藏
1前言
1.1植物内生真菌的定义
植物内生真菌（Endophytic fungi）是指在健康植物寄生的，在各种组织和器官内部或细胞间隙中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类真菌，这是内生真菌的广义定义，包括了菌根真菌和所有植物病原菌在内的一个大类群。目前的内生真菌研究中，多数研究者倾向于一种狭义的概念—植物内生真菌是生活在地上部分活的植物组织内并不引起明显病害症状的一类真菌。
1.2植物内生真菌的应用
目前，内生真菌的研究主要集中在2个方面：（1）植物中的内生真菌对植物本身的影响，（2）对植物内生真菌次生代谢产物的研究。重点是发现具有各种生物活性的新的化合物。
内生真菌分布于植物组织内，可获得足够的碳源、氮源，而且受到植物组织的良好保护，因而比暴露于恶劣环境的附生菌和腐生菌具有更稳定的生存环境，更易于发挥作用。
2试验目的与方法
2.1试验目的与意义
云南榧树（Torreya yunnanensis）属于红豆杉科的榧树属，主要分布于云南西北部的丽江、维西、贡山、中甸等地，是珍稀濒危物种。云南榧树不仅经济价值高，其医用、药用价值也很高。本试验基于云南榧树的药用功能，分离其内生真菌，旨在能分离纯化出对医用、药用研究有益的真菌。
2.2试验材料和设备
2.2.1材料与试剂。云南榧树：研究样品采集自云南省迪庆州维西县，选用无可见病斑的、健康的云南榧树茎和叶;无菌水、马铃薯、琼脂、蔗糖、硫酸链霉素、75%的酒精、0.13%的升汞、水。
2.2.2培养基。真菌的培养采用PDA琼脂培养基，PDA的配方为：去皮马铃薯200g，琼脂12～15g，蔗糖20g。
2.2.3仪器与设备。无菌材料袋、封口膜、报纸、棉线、烧杯、锥形瓶、培养皿、试管、量筒、试纸、酒精灯、打火机、镊子、解剖刀、解剖剪、解剖针、电子天平、普通天平、高压灭菌锅、超净工作台、微波炉以及冰箱等。
2.3试验方法
2.3.1培养基的配置及准备。去皮马铃薯200g，加水熬出马铃薯汁;取15g琼脂，将琼脂加水后加热使之溶解;将马铃薯汁和琼脂混合后加入20g蔗糖，待蔗糖溶解后，加蒸馏水定容至1L。溶液配好后测试其pH值，要求其pH值约为5.6～5.8，若其pH值不在此范围内，用1moL/L的HCL或1moL/L的NaOH调节。
为了确定植物内部环境对内生真菌的培养有无更好的效果，用同样的步骤配置1份PDA培养基，但在定容时用云南榧树茎、叶熬的汁定容。用蒸餾水定容的培养基记为“PDA（水）”，用云南榧树汁定容的培养基记为“PDA（汁）”。
将制作好PDA培养基分装在500mL的锥形瓶里，用封口膜和报纸将瓶口封好;用报纸包好试验过程中所用的相关器械用品;取5瓶蒸馏水用封口膜和报纸封好;把培养基、蒸馏水和相关器械用品放入高压灭菌锅内进行121°C高温高压灭菌30min，以备使用。
2.3.2内生真菌的分离与培养。（1）操作过程。①在超净工作台上，将云南榧树茎和叶用75%的酒精漂洗5min，再用0.13%的升汞浸泡15min进行材料表面消毒，接着用灭菌后的蒸馏水漂洗4次，清除材料表面的消毒液;②在灭过菌的培养皿中将叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，且叶片两端都要用解剖刀切出切口以便内生真菌的长出;将嫩茎切成0.5cm的小段，把老茎的茎皮用解剖刀取下切成0.5cm×0.5cm的小块，分别置于PDA（水）和PDA（汁）培养基上，每皿3～5块，再用封口膜把培养皿封好;再取l皿PDA（水）和l皿PDA（汁）培养基，对所消毒材料冲洗后的第4次无菌水进行涂板培养，以作空白对照;③避光培养3～7d，每天观察。
2.3.3内生真菌的纯化。取切口处新长出的菌丝，及时转接至新鲜PDA培养基上，每种菌丝转接2皿。新鲜PDA原料为PDA（水），但在PDA（水）里加入硫酸链霉索抑制细菌的生长，便于得到纯真菌。待新的培养基上长出菌丝后，再转接至新鲜PDA培养基上，反复多次得到形态完全一致的单菌落即纯化的内生真菌。
2.3.4内生真菌的保存。①试管斜面保存。把纯化的真菌转接至试管内，每株转接3支，用报纸包好放入冰箱内保存。培养皿用封口膜紧封住。②甘油冷冻保藏。试管斜面只能作菌株临时保存，为了使分离的菌种能长期保存，也对10株内生真菌进行甘油冷冻保藏。
20%（V/V）甘油的制备：取20mL甘油加入80mL蒸馏水，混匀。用注射器分别取1.8 mL加入冻存管中，放入冻存盒，高温高压灭菌30min，冷却后备用。每支甘油管中放3～4块带菌培养基，放入4℃冰箱冷藏24h后，转入-20°C冷冻24h，结冰后转入-40℃冰柜长期保存。
3结果与讨论
根据试验统计，结果表明：用云南榧树茎、叶熬的汁定容的PDA和用蒸馏水定容的PDA对云南榧树内生真菌的生长影响不大;在所选3种材料中，最先长出内生真菌的是茎皮，接着是嫩茎，最后是叶片。不同的内生真菌在生长后期表现出较大的差异，生长前期菌丝多为白色，后期菌丝多能够产生色素，而且形态不一。
（1）内生真菌系统地分布于植物体根、茎、叶、花、果实和种子等器官、组织的细胞或细胞间隙。近年来，已从宿主植物的根、茎、叶及储藏器官内分离到大量内生真菌。该试验从云南榧树植株茎皮、嫩茎中分离出真菌数量较多，从叶中分离出少量内生真菌;叶中分离的内生真菌数量少是因为本身叶片真菌数量就少，还是因为叶片切口与培养基的接触面积过小还有待探究。
（2）在内生真菌分离过程中，检测超净台内环境的无菌状态十分必要，否则空气中的杂菌落到材料表面，且长出菌落，就无法察觉，而且单设漂洗液检验法、组织印迹法或组织压入法为对照处理都不严密，因此应同时设置超净工作台无菌状态检测对照、漂洗液无菌检验对照和组织印迹无菌检测对照3种对照处理，以确保准确分离植物内生真菌。
（3）菌种保藏主要是根据微生物生理生化特点，人工创造条件，使微生物代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济。斜面保藏也称传代培养保藏法，此法操作简单，但保存时间短，需要经常移种，易于变异，只能作为菌种的短期保藏。而甘油冷冻保藏法简单有效，保藏时间可达2～10年。为菌种的长期保存和后续研究提供了便利。
（4）本次研究以云南榧树为研究对象，对其内生真菌进行了分离和保藏，为药用相关活性物质的研究奠定了基础。
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