间作木薯对橡胶树根际土壤真菌群落结构的影响

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　　摘  要：研究間作木薯对橡胶树根际土壤真菌群落多样性变化规律，为判断胶园间作木薯的可行性提供理论支撑。以橡胶与木薯间作为处理，橡胶单作为对照，采用传统方法和高通量测序技术分析橡胶树根际土壤理化性状及真菌群落结构。结果表明：（1）间作模式下橡胶树根际土壤的碱解氮、速效磷、速效钾、有机质含量和真菌Shannon指数显著降低，真菌Simpson指数显著提高，pH和Chao1指数虽有降低，但差异未达到显著水平;（2）门分类水平上，2个处理的橡胶树根际土壤真菌群落结构组成相近，共有的3大优势菌门均为Ascomycota、Zygomycota和Basidiomycota。间作木薯降低了橡胶树根际土壤中Zygomycota和Basidiomycota的相对丰度，但提高了Ascomycota相对丰度，达到91.54%;（3）属分类水平上，2个处理中相对丰度比例前10的优势菌属占所有检测出菌属的61.30%～65.59%，间作木薯提高了橡胶根际土壤中Phyllosticta、Gibberella和Lecythophora的相对丰度;（4）土壤碱解N、速效P和速效K含量对橡胶树根际土壤中真菌群落α-多样性产生影响，土壤真菌多样性变化与土壤有机质含量有关。因此，间作木薯增加了植物对土壤矿质营养元素的吸收，导致橡胶树根际土壤肥力下降，进一步降低了橡胶树根际土壤真菌的群落多样性，同时增加了病原真菌的丰度。
　　关键词：橡胶木薯间作;高通量测序;根际土壤;真菌群落结构
　　中图分类号：S794.1; S154.3      文献标识码：A
　　Effects of Rubber-cassava Intercropping on Soil Fungal Community Structure in Rhizosphere of Rubber Trees
　　LIU Zifan， LIU Peipei， YAN Wenjing， MA Xiaowei
　　College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
　　Abstract： To explore the effect of rubber-cassava intercropping on the soil fungal community structure in the rhizosphere of rubber trees， the soil physiochemical properties， fungal community structure in the rhizosphere of rubber trees were analyzed by traditional and high-throughput sequencing techniques. Compared to rubber monoculture， the contents of soil alkalide N， available P， available K， organic matter and Shannon index of fungal diversity in the rhizosphere of rubber trees of rubber-cassava intercropping were significantly decreased， but the Simpson index was significantly increased. In addition， there were no significant differences for soil pH and chao1 index. Ascomycota， Zygomycota and Basidiomycota were the three dominant fungi at phylum level for both intercropping and monoculture treatments， but compared to monoculture， the relative abundance of Zygomycota and Basidiomycota were decreased， and Ascomycota was increased to 91.54% in intercropping treatment. At the genus level， the top 10 fungal genera accounted for 61.30%65.59% of the total genera. The relative abundance of Phyllosticta， Gibberella and Lecythophora were higher in the intercropping treatment. The α-diversity of fungi was not only interfered by the content of soil alkalide nitrogen， available phosphorus and potassium， but was also affected by the content of soil organic matter. It indicated that rubber-cassava intercropping significantly decreased soil nutrients content and fungal diversity in the rhizosphere of rubber trees. Meanwhile， the relative abundance of soil pathogenic fungi in the rhizosphere was also enriched by intercropping treatment. 　　Keywords： rubber tree intercropping with cassava; high-throughput sequencing; rhizosphere soil; fungal community structure
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.026
　　橡胶林是我国种植面积最大的热带经济林，是热区农林经济的重要来源[1]。林下经济是一种投入小、见效快的人工生态经济复合系统[2]。由于木薯耐瘠薄，可在荒山荒坡种植等，因此，于幼龄胶园间作木薯模式受到了胶农的关注和重视[3-4]。但有学者认为，幼龄胶园间作木薯会引起胶园地力减退[5]、橡胶棒孢落叶病和白根病等真菌病害的互相传染[6-7]，严重影响着这一模式的推广与应用。土壤微生物在控制植物养分利用率和土壤质量方面起着重要作用[8]。土壤微生物的种类、数量和活性可以全面、真实地反映土壤的营养状态[9]，土壤微生物多样性与植物的健康紧密相关[10]。
　　目前，前人仅从木薯化感物质对橡胶树棒孢落叶病和白根病病菌影响的角度阐述了胶园间作木薯合理与否[11-12]。土壤根际属于特殊的生态系统，是有益及有害微生物与宿主植物发生复杂相互作用的微小生态系统[13]。土壤真菌是土壤微生物的主要成员，植物病害中，大部分病害是由真菌侵染引起[14]，因而土壤真菌的群落结构可作为土壤生态状况的生物指标。鉴于此，本研究以间作木薯1年的胶园为研究对象，采用传统方法和高通量测序技术，分析橡胶树根际土壤理化性状及真菌群落结构，探究橡胶与木薯间作模式下，橡胶树根际土壤真菌群落结构的变化规律，为判断胶园间作木薯的可行性提供一定的理论支撑。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　木薯品种为‘华南8号’，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供;橡胶品种为‘热研7-33-97’，由中国热带农业科学院橡胶研究所提供。
　　1.2  方法
　　1.2.1  土壤样品采集  土壤样品采集地点位于海南省文昌市迈号镇凤池村橡胶林地（北纬19.56°，东经110.76°）。该林地为平地，四周生境一致，土壤类型为红壤，试验前对样地多点采样，测定土壤理化性质，控制其变异系数在10%以内。林地土壤基本理化性质：pH 4.8、有机质6.88 g/kg、碱解氮58.82 mg/kg、速效磷29.78 mg/kg、速效钾64.30 mg/kg。橡胶树定植时间为2016年3月，种植规格为4.6 m×5.0 m，采用一行橡胶树4行木薯的间作模式，木薯株行距为0.8 m×0.7 m，未施任何肥料。
　　2017年2月26日收获木薯，2月28日采集土样。具体方法为：排除边行橡胶树，于每种种植模式中随机选取面积为23 m×25 m的3个样方，从每个样方中随机选取橡胶树3株，完整挖出橡胶植株，轻抖后刮取根表土作根际土，同一样方内的土样混合均匀作为1个混合样，样品采集后低温运输至实验室。将采集的土壤过1 mm筛，混匀后分成2份装入自封袋中，1份用于土壤微生物的测定，另1份经室内通风处风干，用于土壤基本理化性质指标的测定。
　　1.2.2  土壤基本理化性质的测定  土壤基本理化性质的测定，参照鲍士旦[15]方法。pH采用电位法;有机质含量采用重铬酸钾外加热法;碱解氮含量采用碱解扩散法;速效磷含量采用钼锑抗比色法;速效鉀含量采用火焰光度计法。
　　1.2.3  土壤微生物基因组DNA提取和宏基因组测序  土壤总DNA提取：按照MoBio土壤提取试剂盒（MoBio Power Soil extraction kit，Carl sbad，CA，USA）操作说明书提取土壤样品总DNA，20 ℃保存备用。扩增方法参考Agrios[14]。18S r DNA（NS1- FUNG）区扩增引物：NS1（5CCTA CACG A CGCT C T TCCGATCTN3）、Fung（5GACTG GA G T T C CT T G GCACCCGAGAATTCCA3）。PCR产物送到上海生工生物工程股份有限公司完成Miseq测序。
　　1.3  数据处理
　　土壤微生物Alpha多样性指标包括Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数，各指数的计算方法参考史芳芳等[13]。数据处理采用Excel软件，统计分析采用SAS 9.4软件。
　　2  结果与分析
　　2.1  间作木薯对橡胶树根际土壤理化性质的影响
　　从表1可知，间作木薯胶园中橡胶树根际土壤与单作胶园中橡胶树根际土壤相比，碱解氮、速效钾、速效磷和有机质含量显著降低，而pH虽有下降，但两者之间未达到显著差异。
　　2.2  根际土壤真菌群落多样性分析
　　2.2.1  测序质量  间作和单作模式下橡胶树根际土壤真菌群落多样性的测序质量见表2。从表2
　　可知，间作和单作模式下橡胶树根际土壤的原始序列分别为91 027和83 779条;去除低质量序列、Barcode序列和引物序列后，得到的有效序列数无明显差异，分别为87 609和73 883条有效序列;经过RDP数据库的注释及OTU分析后，分别获得1010和1132个真菌OTU，且差异未达到显著水平。2个处理的土壤测序文库覆盖率无明显差异，且均大于0.99，说明测序结果很合理，更深的测序几乎不会产生更多的OTU，土壤的测序文库已达到饱和。
　　2.2.2  根际土壤真菌α-多样性指数分析  生物种群丰富和多样性指数高是生态环境健康稳定的重要表现[16]。α-多样性指数包括群落分布丰度指数Chao1指数和群落分布多样性指数Shannon指数和Simpson指数[13]，Chao1指数越大，表明群落丰富度越大;Shannon指数值越大，表示该样品中的物种越丰富，说明群落多样性越高;Simpson指数值越大，说明生物群落内不同种类生物数量分布越不均匀，优势生物的生态功能越突出[17]。橡胶树根际土壤真菌Alpha多样性指数差异见表3。 　　表3表明，与单作模式下橡胶树根际土壤相比，间作模式真菌Simpson指数增加了13.35%，真菌Shannon指数降低73.39%，两者均达到显著水平（P<0.05）;虽真菌Chao1指数降低12.94%，但两者未达到显著差异。以上结果说明，间作木薯可在一定程度上降低橡胶树根际土壤真菌群落丰富度与多样性，即间作木薯后，橡胶树根际土壤的真菌物种数下降，群落多样性水平降低。
　　2.2.3  根际土壤真菌在门分类水平上的分布差异  2种种植模式胶园中橡胶树根际土壤真菌群落组成在门分类水平上的差异见图1。由图1可知，2种模式下橡胶树根际土壤真菌群落结构组成相近。优势真菌门主要为Ascomycota、Basidio m y c ota、Zygomycota、Chytri diomycota、Glomer o m y cota、Blastocladiomycota和Neocallima stigo my cota，还有一部分是目前还未知的真菌。但各真菌类群所占比例相差较大，Ascomycota、Ba si di o mycota、Zygomycota三者的相对丰度间作模式下橡胶树根际土壤达96.83%，单作模式下橡胶树根际土壤达84.22%;其中间作模式下橡胶树根际土壤Ascomycota相对丰度为91.54%，大于单作模式下的66.55%，但单作模式下橡胶树根际土壤Basidiomycota相对丰度为11.20%，远大于间作模式下的4.29%，Zygomycota相对丰度为5.59%，大于间作模式下的0.73%。
　　2.2.4  根际土壤真菌在属分类水平上的分布差异
　　2种模式下橡胶树根际土壤真菌优势物种在属分类水平上的相对丰度如图2所示。2种模式下橡胶树根际土壤真菌群落结构组成相近，10个优势真菌菌属分别为Phyllosticta、Gibberella、Asper gi llus、Lecythophora、Microascus、Ochroconis、Penic illium、Chamaeota、Trichoderma和Pithoascus，占根际土壤真菌OTU总数的61.30%～65.59%。但主要优势属所占比例相差较大，其中间作木薯模式下橡胶树根际土壤Phyllosticta相对丰度为41.74%，大于单作模式下的18.06%，Gibberella相对丰度为15.84%，大于单作模式下的8.45%;Aspergillus相对丰度为0.40%，小于单作模式下的8.59%;Lecythophora相对丰度为6.18%，大于单作模式下的3.87%。
　　2.3  根际土壤真菌群落结构与根际土壤理化性质的相关性
　　2.3.1  土壤真菌α-多样性指数与土壤理化性质的相关性  真菌的生长受土壤环境因子的影响[18]。根际土壤真菌群落多样性与根际土壤理化性质间的相关性见表4。OTU、Chao1指数和Shan non 指数与土壤碱解N和速效磷含量呈极显著的负相关;OTU和Chao1指数与土壤速效K含量分别呈显著与极显著的负相关。以上结果说明，橡胶树根际土壤碱解氮、速效磷和速效钾含量是影响根际土壤真菌群落多样性的主要土壤肥力因子。
　　2.3.2  土壤优势真菌门水平占比与土壤理化性质的相关性  土壤微生物的群落组成和结构特征主要受土壤理化因子的影响[19]。从表5可知，Ascomycota仅与土壤有机质含量呈显著负相关，与土壤pH、碱解氮、速效磷和速效钾含量无显著相关;Basidiomycota、Zygomycota和Chytridio my cota与土壤pH、碱解氮、速效磷、速效钾和有机质含量均无显著相关;Glomeromycota与土壤碱解氮和速效磷含量呈显著的负相关，与土壤pH、速效钾和有机质含量无显著相关。
　　3  讨论
　　3.1  间作木薯对橡胶树根际土壤真菌α-多样性的影响
　　土壤微生物是土壤生态系统中最活跃和最具影响力的组分之一[20]。本研究中，与单作模式下橡胶树根际土壤相比，间作模式真菌Shannon指数显著降低，真菌Simpson指数显著增加，说明间作木薯可使橡胶树根际土壤真菌物种下降。化感物质可直接或间接影响土壤微生物的菌落结构、数量、组成和微生物多樣性[21]。根际是土壤中受根系分泌物影响的狭窄地带[22]。间作木薯后橡胶树根际土壤真菌物种下降的原因可能与间作后，土壤中增加了木薯根系分泌物，或改变了橡胶树根系分泌物的种类和数量有关。
　　3.2  间作木薯对橡胶树根际土壤真菌群落组成的影响
　　大量研究表明，植物土传病害的病原菌多为真菌[23]，真菌相对数量的降低对减轻橡胶病害起到一定的积极作用[24]。但真菌种类不同，在土壤中发挥的作用也不同[25]，据营养方式的不同可将真菌分为腐生营养型、共生营养型和病原型[18]。所以，不能简单地以真菌数量的降低或增加来判断对植物病害的影响。
　　Ascomycota大多为腐生营养型真菌[26]，是土壤中动植物残体的主要分解者，在养分循环方面起着重要作用[27]。本研究表明，间作木薯后，橡胶树根际土壤的Ascomycota相对丰度增加，达到91.54%。虽然Ascomycota能促进养分循环，但由于橡胶树根际土壤真菌结构已变得相对单一，这一点从土壤真菌α-多样性数据同样可知，进而极大可能地影响着橡胶树病害的发生及其生长发育。Yelle等[26]研究表明，Basidiomycota能很好地降解木质纤维素，与植物形成菌根，促进根系对水分和矿质元素的吸收，改善土壤的物理性质，同时分泌抗菌物质抑制土壤病原菌的生长，保护宿主植物免受病原菌侵袭[27];Zygomycota能促进根系对营养元素的吸收和有机物质分解，提高土壤中有机质和养分含量，有利于根系生长[25];所以，间作木薯后橡胶树根际土壤Basidiomycota和Zygomycota相对丰度的下降，在一定程度上也影响着橡胶树的生长发育。 　　Phyllosticta可寄生于高等植物上引起植物的叶枯、茎枯、根腐、花腐和果腐等，是农作物和其他经济作物的重要病原菌[28];Gibberella是镰刀菌的有性阶段，可引起具有破怀性的植物病害[29];而Aspergillus微生物的代谢产物能有效抑制27种农作物病原菌的生长，相关曲霉可以改善土壤[30]。本研究结果表明，间作模式下橡胶树根际土壤的Phyllosticta和Gibberella相对丰度增加，Aspergillus相对丰度减小，说明间作木薯后橡胶树根际土壤的致病真菌相对丰度增加。
　　3.3  根际土壤理化因子与根际土壤真菌结构相关性的分析
　　不同的种植模式可以通过对土壤的理化性质、微生物的环境条件和作物间化感作用来改变土壤微生物的群落结构和功能[31]。Güsewell等[32]研究表明，在低N、P丰富环境中，细菌活性明显高于真菌，而在高N、P匮乏环境中，真菌活性则显著高于细菌。本研究的根际土壤碱解N含量大于150 mg/kg，速效P含量大于20 mg/kg，含量均丰富，其环境更利于细菌的生长，从而导致真菌α-多样性降低。
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