花生土壤酚酸降解菌的分离和鉴定

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　　摘要 [目的]探寻植物化感自毒化合物降解菌，更好地防治作物连作障碍。[方法]利用化感物质香草酸为唯一碳源，通过平板分离技术和液体培养高效液相色谱技术从花生土壤中分离筛选出1株降解香草酸的目的菌株V-5。對V-5进行底物降解范围的检测，并对其进行形态、生化特征和16S rRNA 基因分子系统学研究。[结果]V-5菌株可以降解多种酚酸，其降解率分别为香草酸99.93%、对羟基苯甲酸99.85%、肉桂酸17.44%、丁香酸90.04%、苯甲酸98.69%、阿魏酸38.89%;该菌株为革兰氏阴性短杆菌，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，水解精氨酸，同化葡萄糖、甘露糖、葡萄糖酸盐、癸酸、苹果酸、柠檬酸和苯乙酸，细胞色素氧化酶阳性，与恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）非常相似。16S rRNA 基因系统发育分析表明V-5菌株与恶臭假单胞菌亲缘关系最近，序列相似度高达99%以上，因此鉴定所分离的酚酸降解菌V-5为恶臭假单胞菌。[结论]该研究为深入开发应用植物化感物质降解菌，促进农业可持续发展提供了理论依据。
　　关键词 花生;连作障碍;酚酸;降解菌
　　中图分类号 X172  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）05-0093-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.025
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract [Objective]To explore the degradation bacteria of plant allelochemicals and autotoxic compounds and better control crop continuous cropping obstacles. [Method]Using the allelochemical vanillic acid as the sole carbon source， a strain V5 which degraded vanillic acid was isolated and screened from peanut soil by plate separation technique and liquid culture high performance liquid chromatography.The degradation range of V5 was detected， and its morphology， biochemical characteristics and molecular phylogenetic analysis of 16S rRNA gene were studied.[Result]V5 strain could degrade various phenolic acids， the degradation rate of vanillic acid 99.93%， phydroxybenzoic acid 99.85%， cinnamic acid 17.44%， Syringate 90.04%， benzoic acid 98.69%， ferulic acid 38.89% respectively;the strain was a short rod shaped Gramnegative bacterium， which could reduce nitrate to nitrite， hydrolyze arginine， assimilate glucose， mannose， gluconate， citric acid， malic acid， citric acid and phenylacetic acid， cytochrome oxidase Positive， very similar to Pseudomonas putida.The phylogenetic analysis of 16S rRNA gene showed that the V5 strain had the closest relationship with Pseudomonas putida， and the sequence similarity was over 99%. Therefore， the isolated phenolic acid degrading bacteria V5 was identified as a strain of Pseudomonas putida.[Conclusion]This study provides a theoretical basis for the further development and application of plant allelochemical degrading bacteria and the promotion of sustainable agricultural development.
　　Key words Peanut;Continuous cropping obstacle;Phenolic acids;Degrading bacterium
　　花生（Arachis hypogaea L.）是世界上重要的油料作物，2016年我国总产量1 700万 t，占世界总产量的40%。作为我国第一大油料作物，近年来花生播种面积稳定在466.67 万hm2左右，其中连作花生所占面积逐渐增加，产生越来越严重的连作障碍（continuous cropping obstacle）[1-3]——在同一块地上连续两茬以上种植同种或同科作物，即使采用正常的栽培管理措施也会发生作物产量降低、品质变劣和生育状况差等现象，影响了花生产业的可持续发展。 　　花生连作障碍的原因机理复杂，概括而言主要跟土壤理化性质恶化、植物化感物质自毒作用、土壤微生物区系失衡等因素有关[4]。连作花生的化感物质种类较多，包括酚酸类、脂肪酸类、醇類、醛类及酮类等[5]。连作积累的酚酸具有较强的自毒作用，李培栋等[6]通过高效液相色谱法测定了单作花生田土壤中的对羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸等酚酸，发现它们随花生连作年限的增加而增加，连作10年后3种酚酸总量达 11.09 mg/kg，显著高于连作3年和6年的土壤。对羟基苯甲酸、香草酸和香豆酸等酚酸类物质对花生幼苗的株高、根长和根系活力都表现出抑制作用，并且抑制程度随酚酸处理浓度的增加而增强[6]。此外，酚酸还可增加花生的发病率，可能是因为酚酸物质破坏花生细胞膜的完整性而使病原菌入侵，影响花生生长，产生连作障碍[6-7]。Patterson等[8]研究了10-3 mol/L浓度下的10 种有机酸对大豆生长的生理与光合效应，结果表明咖啡酸等6种有机酸明显抑制大豆生长[8]。杜英君等[9]从大豆根系分泌物和植物水浸液中分离出了酚酸物质香草酸、香草醛和对羟基苯甲酸，这类物质与大豆连作障碍有直接关系。
　　不少学者研究发现，随着连作年限增加，花生根际及非根际土壤中的细菌和放线菌数量明显减少，真菌数量明显增加，土壤微生物从细菌型向真菌型转化，尤其是病原性真菌类群，如尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、黑曲霉（Aspergillus niger）等[10-12]。其他油料作物如大豆也存在连作障碍菌群失衡的情况。
　　鉴于上述原因，寻找开发能降解花生自毒化感物质酚酸的菌株资源，不仅有望减轻花生土壤酸化、改善土壤理化条件，减少酚酸对花生生长发育的抑制作用，而且还能直接或间接抑制病原真菌的生长繁殖，改善花生根际微生态环境，从而缓解和防治花生连作障碍。为此，笔者分离降解酚酸的细菌资源并进行分类鉴定，以期为开发菌株资源制备连作障碍生防菌剂提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 样品和培养基
　　土壤样品来自山东省荣成市一多年种植花生的农田土。香草酸无机盐液体培养基：香草酸 0.5 g，KNO3 0.2 g，Na2HPO4 5 g，KH2PO4 3 g，NaCl 0.5 g，CaCl2 0.003 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，蒸馏水 1 000 mL，121 ℃条件下灭菌 20 min。香草酸无机盐固体培养基：香草酸无机盐液体培养基中加入20 g/L的琼脂。
　　1.2 香草酸降解菌的分离筛选
　　称取5 g土壤样品加入45 mL无菌水中振荡混匀，并进行 10 倍系列稀释，分别制成 10-1、10-2、10-3、10-4 浓度的菌悬液。各浓度菌悬液分别取100 μL，加到香草酸无机盐固体培养基平板上涂布均匀，每个浓度设3次重复。将平板放置于 37 ℃恒温培养箱中培养，每天观察菌的生长状况，待长出清晰可见的菌落后通过平板划线法分离纯化，从而分离筛选出以香草酸为唯一碳源和能源生长的菌株。将分离筛选的目的菌株单菌落转接入香草酸无机盐液体培养基，在 37 ℃下150 r/min 振荡培养5 d，以不接菌的空白培养基作对照，用高效液相色谱法（high performance liquid chromtography，HPLC）检测香草酸含量，从而筛选出可以降解香草酸的目的菌株备用。HPLC检测采用Waters 高效液相色谱仪，色谱柱采用 C18反相色谱柱，检测器采用 Waters 2996 Photodiode Array Detecter，以1%甲酸/甲醇（40∶60）为流动相;流速 1.0 mL/min，检测波长290 nm[13]。
　　1.3 香草酸降解菌的底物降解谱
　　将筛选的香草酸降解菌分别取培养液 3 mL接入 30 mL 分别以香草酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、丁香酸、苯甲酸、阿魏酸作底物的无机盐液体培养基中，底物浓度均为0.5 g/L。分别取零时样品和 37 ℃下150 r/min 振荡培养5 d的末时样品，过滤后用HPLC检测底物量，从而计算底物降解效率=[（零时底物量-末时底物量）/零时底物量]×100%，得到酚酸降解菌的底物降解谱。
　　1.4 降解菌的形态及生化特征鉴定
　　在香草酸无机盐固体培养基平板上观察菌落形态;从单菌落上挑菌至滴加蒸馏水的载玻片上制备菌株涂片，经革兰氏染色后进行光学显微镜观察，明确菌体的形态。选择API细菌鉴定试剂盒，根据产品使用说明书进行菌株的生化反应试验并按时观察结果。
　　1.5 降解菌的分子系统学鉴定
　　1.5.1
　　菌株16S rRNA基因的PCR扩增和测序。将分离筛选的降解菌单菌落接种营养肉汤培养基，37 ℃下200 r/min振荡培养过夜，吸取1 mL菌液离心收集菌体，用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取菌株的基因组DNA。以基因组DNA为模板，用针对细菌16S rRNA基因的引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）与1541R（5′ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[14]通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增目的菌株的16S rRNA基因，用1%琼脂糖凝胶电泳检测1.5 kb左右的PCR产物，获得的PCR产物送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。
　　1.5.2
　　16S rRNA基因的分子系统学分析。将测得的基因序列通过NCBI网站的 BLAST软件与 GenBank 数据库中的序列进行比对，选取不同相似度的代表菌株下载其16S rRNA基因序列，用ClustalX 2.1软件进行序列比对分析，然后应用 MEGA7 软件通过Maximum Likelihood方法构建相关菌株16S rRNA基因的系统发育树。 　　2 结果与分析
　　2.1 降解菌的分离筛选
　　利用香草酸无机盐固体培养基分离筛选到能以香草酸为唯一碳源和能源生长的菌株V-5。该菌株菌落较小，边缘光滑整齐，表面隆起，有光泽，呈乳白色（图1），V-5菌株转接香草酸无机盐液体培养基培养5 d后经HPLC检测可以降解香草酸。
　　2.2 菌株的酚酸底物降解谱
　　将V-5菌株的香草酸液体培养物分别接种香草酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、丁香酸、苯甲酸和阿魏酸作唯一碳源的液体培养基，37 ℃振荡培养5 d，通过HPLC检测分析，结果表明菌株V-5不仅可以高效降解香草酸（降解率达99.93%），对其他几种测试的酚酸化合物也具有不同程度的降解作用（图2）。其降解率分别为对羟基苯甲酸99.85%、肉桂酸17.44%、丁香酸90.04%、苯甲酸98.69%、阿魏酸 38.89%。由此可见，V-5菌株的酚酸降解谱较宽，其降解香草酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸、丁香酸的能力都较强。
　　2.3 降解菌的形态及生化特征鉴定
　　对菌株V-5进行革兰氏染色后镜检发现，该菌为革兰氏阴性短杆菌。进一步用 API 20 NE 非肠道革兰氏阴性杆菌试剂盒对其进行生化鉴定，结果表明，菌株V-5能还原硝酸盐为亚硝酸盐，能水解精氨酸，可以同化葡萄糖、甘露糖、葡萄糖酸盐、癸酸、苹果酸、柠檬酸和苯乙酸，细胞色素氧化酶阳性。菌株V-5的吲哚反应呈阴性，不能酸化葡萄糖，不能水解尿素、七叶灵、明胶、对硝基-β-D-甲基半乳糖，不能同化阿拉伯糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、己二酸。根据API 20NE试剂盒使用说明和V-5菌株的生化反应谱在线查询鉴定结果，发现该菌株可能为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），鉴定指数为 93.4%。
　　2.4 菌株的分子系统学鉴定
　　提取V-5菌株的基因组DNA后，利用27F和1541R引物进行PCR反应，结果扩增出约1.5 kb的PCR产物，将产物寄送至上海铂尚生物有限公司进行测序，获得了一段1 440 bp的DNA序列，该序列已提交GenBank（accession number MN314837）。
　　将V-5菌株的DNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析，结果发现V-5菌株与假单胞菌属（Pseudomonas）多个成员的16S rRNA基因具有高度相似性，進一步下载相关菌株的16S rRNA基因序列，通过ClustalX 2.1比对分析后用 MEGA7 构建分子系统发育树（图3）。
　　假单胞菌属是变形菌门γ-变形菌纲假单胞菌目假单胞菌科的一个属，包含众多的种[15]。从以上系统发育树（图3）可以看出，分离得到的香草酸降解菌V-5与假单胞菌属的与恶臭假单胞菌种（Pseudomonas putida）的亲缘关系最近，在系统发育树上紧密地聚集于同一进化支，序列相似度高达99%以上，因此推断V-5菌株为1株恶臭假单胞菌。
　　该研究还表明，V-5菌株的16S rRNA基因分子系统学分析结果与API 20NE 试剂盒鉴定结果一致，进而印证所获得的V-5菌株是1株恶臭假单胞菌。
　　3 讨论
　　随着农业生产规模化、集约化的发展，农作物连作障碍问题日益突出。容易发生连作障碍的农作物不仅限于花生、大豆等豆科作物，还发生于茄科作物如番茄、辣椒、茄子，十字花科作物如白菜、甘蓝，葫芦科作物如甜瓜、西瓜、黄瓜[16]，蔷薇科作物如苹果、草莓等[17]。在这些连作障碍植物中，根分泌物介导着土壤微生物种群组成和多样性[18-19]，而土壤微生物在调节土壤肥力、改善土壤环境方面发挥重要作用并密切影响植物的生长发育和健康。
　　为筛选高效化感物质降解菌，钱娜等[20]以花生根系分泌物中的化感物质苯甲酸作唯一碳源，从连作花生长期定位试验地的健康花生植株根际土壤中筛选出2株高效花生化感物质降解菌，经鉴定分别为木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans HJ-2）和硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducens HJ-3），2株菌都能降解苯乙酮、硬脂酸、棕榈酸、乳酸、3，5-二甲基苯甲醛和丙三醇等化感物质，为菌株的资源开发奠定了良好的基础。
　　Chen等[12]通过16S rRNA 基因克隆文库技术研究了连作花生土壤的细菌种群演替，认为交替单胞菌目、伯克霍尔德氏菌目、黄杆菌目、假单胞菌目、 根瘤菌目和红螺菌目等有益微生物种群的简化是连作条件下花生产量下降的重要因素。该研究以香草酸作唯一碳源首次从花生土壤中分离筛选到香草酸降解菌——恶臭假单胞菌V-5，属于假单胞菌目，如果进一步开发应用，对恢复连作花生土壤的有益菌群具有重要意义。
　　自毒化合物[21]。韩丽梅等[22]从番茄的根系分泌物中分离出了香草酸、对羟基苯甲酸、龙胆酸等化感物质。张璐等[23]研究表明，连作甜瓜土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香兰素、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸的含量随着连作年限的增加而增加，连作3年后7种酚酸的总量显著高于未连作土壤。该研究分离到的V-5菌株可以降解香草酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、苯甲酸等酚酸化合物，因而对防治酚酸化合物介导的多种植物连作障碍都具有较大开发价值。
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