多菌灵降解菌株djl-10的分离及降解特性

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　　摘要：从多菌灵生产废水处理系统中，通过富集和选择性培养，分离得到1株能高效降解多菌灵的细菌，并将其命名为djl-10。根据菌株的菌落形态，生理生化特性及基于16S rDNA序列的系统发育分析等，初步将菌株鉴定为分枝杆菌属。该菌株能利用多菌灵作为唯一碳源、氮源进行生长并基本彻底矿化多菌灵。2-氨基苯并咪唑和2-羟基苯并咪唑为菌株降解多菌灵的中间代谢产物。菌株能够在较宽温度和pH值范围内有效降解多菌灵，其降解多菌灵的最适温度和pH值分别为37 ℃、7.0。装液量试验结果表明，菌株djl-10对多菌灵的降解明显依赖氧气。Ca2+、Mg2+、Fe3+等离子能够明显促进菌株djl-10对多菌灵的降解。此外，本研究克隆和表达菌株djl-10的多菌灵水解酶基因mhe。酶促反应结果表明，纯化的重组酶Mhe对多菌灵具有明显的催化活性。
　　关键词：分枝杆菌;多菌灵;生物降解;废水处理系统
　　中图分类号：X172 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）23-0284-05
　　多菌灵是一种广谱、内吸性杀菌剂，廣泛应用于防控各种农作物的真菌病害[1]。许多苯并咪唑类和托布津类杀菌剂均可在作物体内转化为多菌灵而起作用[2]。多菌灵同时还是一种持久性环境污染物，其半衰期在表层土壤中约为3～15周[3-4]。值得注意的是多菌灵在土壤和水体中长期残留会进一步污染食品，危害人们身体健康[5-6]。研究表明，多菌灵对动物的肝脏和内分泌系统有害，是一种“三致”物质，既使在较低浓度下也会对生物体造成伤害[7-8]。我国每年多菌灵的生产量已超过10 000 t[9]。经生产和使用途径多菌灵进入环境中，并在土壤、河流中残留，对各种生物的生长繁殖以及人们的食品安全和身体健康造成潜在的危害。目前，已经报道多种多菌灵降解菌株[7-12]。本研究分离得到1株能高效降解多菌灵的分枝杆菌菌株，并对其降解特性进行初步研究，以期进一步丰富高效多菌灵降解菌株的资源库。
　　1 材料与方法
　　1.1 化学试剂与培养基
　　多菌灵（纯度>98.0%），由江苏新沂农药厂赠送;用于高效液相色谱分析的色谱纯甲醇，购自江苏汉邦科技股份有限公司。其他化学试剂均为普通国产分析纯试剂。
　　基础盐（MSM）培养基配方：1.0 g/L NaCl，1.0 g/L NH4NO3，1.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，1 000 mL 去离子水;富集分离培养基：在基础盐培养基中添加0.01%的多菌灵原药作为唯一碳氮源;LB培养基配方：10.0 g/L 胰蛋白胨，5.0 g/L酵母粉，5.0 g/L NaCl，1 000 mL 去离子水。
　　1.2 菌株的富集与分离
　　取多菌灵生产废水处理系统中的5 mL活性污泥加入到100 mL富集培养基中，在30 ℃，180 r/min条件下振荡培养。每隔4 d取5 mL富集培养物接种至100 mL新鲜富集培养基中。经连续3代富集后，取富集液梯度稀释涂布到含过饱和多菌灵的基础盐琼脂平板上，30 ℃培养3 d。周围有透明圈的菌落即为疑似多菌灵降解菌，将这些菌株用固体LB培养基平板划线分离，纯化后进一步验证其多菌灵降解能力。
　　1.3 菌株鉴定
　　采用高盐法提取菌株基因组DNA作为模板，以细菌16S rDNA通用引物PCR扩增菌株16S rDNA序列。PCR扩增产物TA克隆后，转化大肠杆菌 DH5α菌株感受态细胞，挑选阳性转化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序序列提交到NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行在线分析，利用Blast软件在GenBank中与其他菌株16S rDNA序列进行同源性比对。采用软件Mega 6.0，通过邻结法构建系统进化树。菌株djl-10 16S rDNA序列的GenBank登录号为KX509812。
　　1.4 多菌灵降解及检测
　　1.4.1 菌悬液制备 接种菌株dj1-10至液体LB培养基中，在30 ℃，180 r/min条件下振荡培养3 d，离心收集菌体，用MSM培养基洗涤并重悬菌体至D600 nm≈1.0。
　　1.4.2 降解体系构建 以1%的接种量，接种菌悬液至MSM液体培养基中，并添加终浓度为100 mg/L的多菌灵作为唯一碳源和能源。当以多菌灵为唯一氮源时，向降解体系中添加100 mg/L葡萄糖。所有处理均设置3次重复，在30 ℃，180 r/min 条件下振荡培养，按特定时间间隔取样待测。
　　1.4.3 样品处理 向待测样品中加入等体积二氯甲烷，剧烈振荡2 min，静置分层后吸出水相，有机相在通风橱中充分挥发后加甲醇重新溶解定容，用0.22 μm一次性有机相过滤器过滤后进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，简称HPLC）分析。
　　1.4.4 样品检测 样品中多菌灵残留浓度采用HPLC法检测，色谱条件为Agilent 1260高效液相色谱仪，Kromasil 100-5 C18反向柱（4.6 mm×25.0 cm），流动相为甲醇与0.02 mol/L醋酸铵体积比为65 ∶ 35，流速为1 mL/min，检测波长为 286 nm，室温检测。
　　1.5 环境条件对菌株降解多菌灵的影响
　　1.5.1 温度的影响 将降解体系分别置于20、25、30、37、40、45 ℃条件下振荡培养24 h，取样测定不同温度下菌株 djl-10对多菌灵的降解率。
　　1.5.2 初始pH值的影响 根据“1.5.1节”中试验选择温度为 37 ℃。分别用盐酸溶液和氢氧化钠溶液将MSM培养基的初始pH值调为5、6、7、8、9后构建“1.4.2节”中的降解体系。在37 ℃，180 r/min 条件下振荡培养24 h，取样测定不同pH值条件下菌株djl-10对多菌灵的降解率。 　　1.5.3 装液量的影响 在100 mL三角瓶中构建降解体系，并设置10、20、30、40、50 mL等5个装液量处理组。在37 ℃，180 r/min条件下振荡培养24 h，取样测定不同装液量条件下菌株djl-10对多菌灵的降解率。
　　1.5.4 不同金属离子的影响 分别向多菌灵降解体系中添加MgCl2、CuSO4、CaCl2、MnSO4、ZnSO4、FeCl3、CoCl2等溶液，设置0.1、1.0、 10.0 mmol/L等3个处理浓度。在37 ℃，180 r/min 条件下振荡培养24 h，取样测定不同金属离子处理条件下菌株djl-10对多菌灵的降解率。以不加金属离子的多菌灵降解体系为对照。
　　1.6 多菌灵水解酶基因mhe的克隆与表达
　　1.6.1 mhe基因的PCR扩增与序列分析 参照文献[8]设计合成多菌灵水解酶基因的PCR引物MheI-F和MheI-R。以菌株基因组DNA为模板，PCR扩增菌株mhe基因片段。PCR产物TA克隆后，挑选阳性转化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序序列提交GenBank进行Blast同源性比对分析。
　　1.6.2 重组表达载体构建 通过引物设计，在mhe基因片段PCR产物的上下游分别引入限制性酶切位点Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ，并通过载体构建的方式将mhe基因片段连接到表达载体pET29a的相应位点上，构建成重组表达载体pET29a-mhe，随后转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。
　　1.6.3 蛋白Mhe诱导表达及纯化 在含50 mg/L卡那抗生素的LB液体培养基中，将重组表达菌株于37 ℃，200 r/min条件下振荡培养至菌体浓度达到D600 nm≈0.5时，加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，简称IPTG），在18 ℃、180 r/min 条件下振荡培养24 h，以诱导蛋白Mhe表达。采用Ni柱亲和层析策略，参照产品说明步骤纯化目标蛋白Mhe。纯化的目标蛋白透析脱盐后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。
　　1.6.4 Mhe酶活力检测 构建酶促反应体系：500 μL 20 mmol/L Tris-HCl （pH值为8.0），25 μL Mhe酶液，5 μL多菌灵母液（终浓度为10 mg/L），37 ℃恒温水浴。平行操作15个反应体系，分为5组，每组3次重复，分别在0、2、4、6、8 h 取样，加入等体积的二氯甲烷终止酶促反应并萃取体系中残留的多菌灵，用HPLC检测分析各组样品中多菌灵的残留浓度。
　　2 结果与分析
　　2.1 多菌灵降解菌株的富集与分离
　　从处理多菌灵生产废水的活性污泥中分离得到1株高效多菌灵降解菌株，命名为djl-10。菌株革兰氏染色为阳性，在LB固体平板上经30 ℃，2～3 d培养后形成黄色菌落。菌株能在以过饱和多菌灵为唯一碳氮源的浑浊基础盐琼脂平板上生长，并在菌落周围和下方形成清晰的透明水解圈（图1）。
　　2.2 菌株djl-10的鉴定
　　菌株djl-10的16S rDNA序列同源性比对分析显示其与分枝杆菌属（Mycobacterium sp.）菌株有较高的同源性，达99%。分枝杆菌属与诺卡氏菌属、红球菌属等在亲缘关系上相近，同时为考察菌株djl-10与其他已报道的多菌灵降解菌株之间的进化关系，从GenBank中调取它们的16S rDNA序列进行聚类分析，构建系统发育树。结果表明，其与Mycobacterium sp.亲缘关系最近（图2）。据此，将菌株djl-10初步鉴定为分枝杆菌属菌株。
　　2.3 菌株对多菌灵的降解及代谢产物鉴定
　　菌株djl-10对多菌灵的降解及生长情况如图3所示，菌株能够以多菌灵为唯一碳氮源生长，并降解多菌灵。当以多菌灵为唯一氮源时菌株的生长和降解均相对较好，菌株能在24 h内将100 mg/L的多菌灵几乎彻底降解。而以多菌灵为唯一碳源或唯一碳氮源时，菌株需要近36 h才能将多菌灵基本彻底降解。以多菌灵为唯一氮源时，体系中添加了葡萄糖，能够促进菌体的快速增加和对多菌灵的降解。因此，葡萄糖的存在应是以多菌灵为唯一氮源时菌株生长和降解更快的原因。
　　根据文献[7-8]报道，2-氨基苯并咪唑（2-AB）和 2-羟基苯并咪唑（2-HB）是多种微生物菌株降解多菌灵的中间代谢产物。在菌株djl-10降解多菌的过程中，通过HPLC分析也检测到了2个中间代谢产物。由图4可知，这2个代谢产物分别与2-AB、2-HB标准品有相同的保留时间，基于此并结合文献报道，将这2个代谢产物初步鉴定为 2-AB 和2-HB，这也说明菌株djl-10降解多菌灵的代谢途径与文献[7-8]报道的多菌灵降解菌株基本相同。
　　2.4 环境条件对菌株djl-10降解多菌灵的影响
　　2.4.1 温度和初始pH值对降解率的影响 由图5可知，在温度低于37 ℃时，多菌灵降解率随着温度升高而升高，但当温度高于37 ℃时，降解率隨着温度升高略有下降。因此，菌株 djl-10降解多菌灵的最适温度为37 ℃。由图6可知，菌株djl-10降解多菌灵的最适pH值为7.0，培养基初始pH值偏酸和偏碱均会抑制多菌灵的降解。
　　2.4.2 装液量对降解率的影响 由图7可知，在100 mL三角瓶中装液量为10、20 mL时多菌灵的降解率明显高于装液量为30、40、50 mL时，且随着装液量的增加，降解率逐渐下降，表明菌株djl-10降解多菌灵对氧气有明显的需求。
　　2.4.3 金属离子对降解率的影响 由图8可知，Mg2+和Ca2+能够明显促进菌株djl-10对多菌灵的降解;Mn2+、Zn2+、Co2+在试验浓度为0.1、1.0 mmol/L时对降解有明显促进作用，但浓度为10.0 mmol/L时对降解作用强烈抑制;Cu2+对降解有明显的抑制作用;值得注意的是，Fe3+在低浓度（01、1.0 mmol/L）时对菌株降解多菌灵的影响不大，但在试验浓度为10.0 mmol/L时对多菌灵的降解有强烈的促进作用。 　　2.5 菌株多菌灵水解酶mhe基因的克隆和表达
　　从菌株dj1-10的基因组DNA中，PCR扩增得到1个特异条带，测序分析表明其为长度为729 bp，起始密码子为ATG终止密码子为TGA，编码242个氨基酸残基的开放式阅读框（ORF）。序列同源性比对分析表明其与已报道的菌株R. erythropolis dj1-11[13]和Nocardioides sp. SG-4G[8]中的多菌灵水解酶基因mhe/mheI的序列相似性分别达到100%、99%。据此，推测该ORF就是菌株djl-10中负责编码多菌灵水解酶Mhe的基因。
　　利用大肠杆菌表达系统表达并纯化菌株djl-10的多菌灵水解酶Mhe，SDS-PAGE分析结果（图9）显示，纯化的Mhe为单一条带，分子量约为26 ku，与基于氨基酸序列推测的理论值（26 251.93 u）相符。酶促反应试验显示纯化的
　　Mhe对多菌灵具有催化活性，如图10所示，在Mhe的催化下，反应体系中多菌灵的残留浓度随时间推移逐步降低。这进一步说明该ORF是菌株djl-10中负责编码多菌灵水解酶的mhe基因。
　　3 结论
　　从多菌灵废水处理系统活性污泥中分离得到1株高效多菌灵降解菌株djl-10，初步鉴定为分枝杆菌属菌株。该菌株能以多菌灵为唯一碳源、氮源和唯一碳氮源生长并基本彻底降解多菌灵。进一步丰富了多菌灵降解菌株的资源库。
　　菌株djl-10降解多菌灵的最适温度和初始pH值分别为37 ℃、7.0。装液量试验结果表明，菌株降解多菌灵时须要好氧环境。Mg2+和Ca2+等多种金属离子对菌株降解多菌灵有明显促进作用;Cu2+对降解有明显的抑制作用;高浓度（10.0 mmol/L）的Fe3+对降解有强烈的促进作用。
　　2-AB和2-HB是菌株djl-10降解多菌灵的中间代谢产物。菌株中负责催化多菌灵降解的第一步反应的编码基因是多菌灵水解酯酶基因mhe，该基因表达的产物对多菌灵有明显的催化活性。
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　　收稿日期：2018-09-03
　　基金项目：国家自然科学基金（编号：31300099）。
　　作者简介：袁巧云（1981—），女，江苏盐城人，硕士，主要从事微生物学研究。E-mail：qiaoyunyuan@163.com。
　　通信作者：张 迹，博士，讲师，主要从事环境微生物学研究。E-mail：zhangjihnu@163.com。
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