白腐菌漆酶降解染料的研究进展

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　　摘要：染料是一种重要的环境污染物，可通过食物链直接或间接影响人们的身体健康。本文概述了近年来白腐真菌漆酶对染料降解的研究进展，重点介绍了漆酶性质和来源、漆酶作用机理、漆酶对染料的降解特性，并指出其中存在的问题。
　　关键词：漆酶；染料；降解；白腐菌
　　中图分类号：Q939.98
　　文献标识码：A
　　
　　染料废水主要来自于纺织印染工业和染料生产行业。随着染料生产与印染工业的发展，其生产废水已成为当前最主要的水体污染源之一。目前世界染料年产量约为8×105－9×105t，我国染料年产量达1.5×105t，位居世界前列，在染料的生产和使用中约有10％～15％的染料随废水排入环境，严重地破坏了水生生态系统，因此亟待寻找高效环保的降解染料或处理染料废水的方法。大量的研究报道表明，白腐菌对染料具有很强的脱色作用，其脱色机制，除开一小部分为吸附脱色外，大多数是通过木质素降解酶系对染料的降解。由于白腐菌生长缓慢，受外部环境影响较大，因此科研工作者试图使用白腐菌的降解酶系来直接处理染料废水。在白腐菌的降解酶系中，木质素过氧化物酶和锰酶的催化反应需要过氧化氢来启动反应，而漆酶是一种氧化还原酶，其作用主要是催化氧化还原反应，能把分子氧直接还原为水，在没有过氧化氢和其它次级代谢产物存在下，可催化大量的酚类和芳香胺类化合物的氧化。因此，在白腐菌的降解酶系中，漆酶受到更多的关注。
　　
　　1　漆酶性质和来源
　　
　　漆酶(Laccase，E.C.1.10.3.2)是一类含铜的氧化还原酶，它能催化多种芳香族化合物(特别是酚类化合物)发生氧化反应，而在反应中分子氧作为电子受体被还原成水。漆酶广泛存在于真菌中，分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌亚门(Basidiomy-cotina)、子囊菌亚门(Ascomyeotina)及半知菌亚门(Deuteromycotina)等高等真菌，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。
　　漆酶一般以单蛋白体的形式存在，其分子量一般在52kDa到110kDa之间，也有些分子量大于110kDa。漆酶分子中一般含有四个铜离子，根据光谱和磁性特征可将其分成三类：1型Cu2+和Ⅱ型Cu2+各一个，是单电子受体，呈顺磁性，可用顺磁共振(ESR)测定；Ⅲ型Cu2+两个，是双电子受体，反磁性，ESR检测不出来。
　　不同来源的漆酶具有不同程度的糖基化，糖基化程度在10％～45％之间，一般情况下真菌漆酶的糖基含量要低于植物漆酶。漆酶是一种含铜的糖蛋白，肽链一般由500个左右氨基酸组成。糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量会随来源不同有着很大的差异，甚至来源相同的漆酶分子量也不会完全相同。漆酶蛋白质部分一般含有一段大约520～600个氨基酸单一多肽序列，其中含19种氨基酸：Asp，Thr，Glu，Set，Pro，Gly，Ala，Val，Cys，Met，Ile，Leu，Tyr，Gin，Phe，Lys，His，Arg，Try。漆酶在和铜原子连接的半胱氨酸和10个组氨酸之中或周围都有严格的保守氨基酸残基，任何情况下这些氨基酸都分布在含有两对组氨酸残基的N－末端区域，或是分布于C－末端的半胱氨酸和其余的组氨酸残基之间。
　　漆酶能催化许多化合物的氧化反应，底物比较广泛，包括许多与对二酚结构类似的化合物，如氨基苯酚，邻、对苯二酚，多酚，多胺，木质素和芳基二胺等。一些漆酶能高效地氧化抗坏血酸，另外一些真菌漆酶还能催化木质素和甲氧基酚酸的脱甲基反应。必须注意的是过氧化物酶和其他一些多酚氧化酶也可以催化类似的反应，但这些酶不会利用分子氧作为第二底物，因此测定催化反应中氧吸收速率可以作为漆酶活性的可靠证据。漆酶的抑制剂大多是铜离子螯合剂，有卤化物、半胱氨酸、EDTA和SDS等，离子强度的不同也会影响酶的活力。
　　多数真菌漆酶的最适反应温度较低，一般在25℃～50℃之间，现在也有较耐高温真菌漆酶的报道，Marsmius quercophilus漆酶在75℃条件下半衰期为10min。多数真菌漆酶的最适反应pH在4.0～6.0之间。刘淑珍等研究发现，一种担子菌漆酶最适反应pH为2.2～2.8；新鲜香菇子实体漆酶的最适反应pH为2.6；刘尚旭等研究的糙皮侧耳Ax3所产漆酶的最适反应pH为2.8；杏鲍菇漆酶的最适反应pH为3，在pH2.5～4.0时酶活较大。同一种漆酶的作用底物有所不同，其最适pH也有差异。蝶形斑褶菇(Panaeolusp apilionaceus)漆酶POXB和POXD以ABTS为底物时的最适反应pH均在2.5左右，而以2，6一二甲氧基苯酚为底物时，最适反应pH分别为6.0和7.0。
　　
　　2　漆酶作用机理
　　
　　漆酶是单电子氧化还原酶，催化不同类型底物氧化反应，机理主要表现在以下两方面：
　　
　　2.1底物自由基中间体的生成
　　漆酶催化邻、对苯二酚(胺)类底物(如氢醌)氧化时，首先是底物向漆酶转移一个电子，生成半醌一氧自由基中间体，用ESR监测反应，能观察到明显的自由基信号；其次是不均衡的非酶反应，二分子半醌生成一分子对苯醌和一分子氢醌。有O2存在时，还原态漆酶被氧化，O2被还原成水。其中E-cu2+，E-cu+分别表示漆酶的氧化态和还原态。氧自由基中间体还可以转变成碳自由基中间体，它们可以自身结合和相互结合，产物中除醌外还有聚合物、C-O和C-C偶联产物。
　　
　　2.2四个铜离子的协同作用
　　漆酶催化底物氧化时，I型Cu2+和Ⅱ型Cu2+首先分别从底物接受一个电子，由二价变为一价，然后通过分子内的电子转移，I型Cu+和Ⅱ型Cu+将电子传递给Ⅲ型Cu2，它们由一价变成二价，Ⅲ型Cu2由二价变成一价。当I型Cu2+和Ⅱ型Cu2+分别再次从底物接受一个电子变成一价时，四个铜离子都是一价，这时漆酶呈还原态。在有O2存在下，还原态漆酶被氧化。O2从I型Cu+和Ⅲ型Cu2迅速接受三个电子，生成光活性氧中间体(Cu2O)4+，并失去一分子水。I型Cu+和Ⅲ型Cu2由一价变成二价，分别在λ614nm和λ330nm处出现特征吸收峰。Ⅱ型Cu+再氧化很慢，氧中间体一直与Ⅲ型Cu2相连，具有顺磁性，它的ESR信号与I型Cu2+和Ⅱ型Cu2+不同，表现出类似于负氧自由基不寻常的性质，当它I型Cu+接受第四个电子还原为水时才脱离Ⅲ型Cu2，这时四个铜离子都是二价，漆酶呈氧化态。这样，通过四个铜离子的协同作用传递电子，同时发生价态变化，实现漆酶对底物的催化氧化。
　　
　　3　漆酶对染料的降解
　　
　　漆酶在小分子的介体物质存在下，可氧化的底物范围还将进一步扩大，即氧化非酶底物。如ABTS作为一个可扩散的木质素氧化中间介体物质。1990年，Bourbonnais和Paice首次报道漆酶与2，2，一连氮－双(3－乙基苯并噻唑－6－磺酸)(ABTS)共存时能氧化非酚型木素模型化合物，还可以用于脱除纸浆中的残余木素。Call报道漆酶和1－羟基苯并三唑(简称HBT)作用于纸浆，能脱除50％的残余木素。漆酶和介体构建的漆酶介体体系(简称LMS)具有替代传统含酚漂白的潜在可能性。国内外都在进一步研究LMS用于纸浆的生物漂白。
　　根据染料结构，可将染料分为漆酶底物类染料和非酶底物类染料。蒽醌类染料是漆酶的底物，可以被漆酶直接氧化，脱色和降解程度与酶活呈正比。与其它类型染料相比，漆酶对蒽醌类染料脱色速度及降解效果都是最快和最好的。偶氮类和靛青类染料不是漆酶底物，它们的降解与漆酶酶活不成正比，在小分子的还原介体存在下(ABTS，HBT等)，可介导漆酶与非酶底物染料之间的氧化作用。试验表明，漆酶对非酶底物染料的降解率很低，当添加小分子介体物质ABTS非酶底物类染料的降解率明显提高，提高比率与ABTS浓度呈正比。漆酶介体系统(LMs)对非酶底物染料的降解机制：漆酶底物即介体(M)，被漆酶氧化形成阳离子自由基(M)，自由基不稳定自动分解为酶氧化反应产物(PM)或者氧化其它非酶底物染料(D)，返回到它的最初状态(M)。被氧化的非酶底物染料也是不稳定的，会分解成最终产物((PD)。被漆酶吸收的电子最终传递给氧气形成水。这说明小分子介体物质对非酶底物染料的降解起到介导电子传递的作用。
　　由于漆酶具有高氧化能力，能催化氧化酚类和合成染料，因此被广泛地用于环境污染物的治理。但漆酶在用于染料废水的实际脱色方面，还存在两个问题：其一，绝大多数真菌的漆酶活性范围在酸性pH范围，而染料废水的pH值变化大，这意味着漆酶的适用性有限；其二，漆酶是真菌的次生代谢产物，产酶条件比较苛刻、时间长，有时需要诱导物诱导，而且酶产量不高难以满足大规模应用的需要。
　　
　　(本文责任编辑　郜金荣)

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