纤维素降解菌的筛选及酶活力测定

来源:用户上传      作者: 高小朋 杨晗 袁茂林 贺晓龙 任桂梅

　　摘要：从延安市宝塔区杨家湾长期堆积牛粪和秸秆的腐殖土中筛选到１７株纤维素降解菌，经刚果红培养基、赫奇逊培养基复筛，得到ＴＣ－２、ＴＣ－４、ＴＣ－５、ＴＣ－６、ＴＣ－８、ＴＣ－１１、ＴＣ－１２、ＴＣ－１３共８株可分解纤维素的菌株，对其进行纤维素酶活力（CMCA）和滤纸酶活力（FPA）的测定。结果表明，菌株ＴＣ－１１产生的两种酶的酶活力均较高，可作为进一步研究的试验菌株。
　　关键词：纤维素；降解菌；纤维素酶活力；滤纸酶活力
　　中图分类号：Ｑ９３－３３１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）15－3072-02
　　
　　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｅｍｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
　　
　　ＧＡＯ Ｘｉａｏ－ｐｅｎｇ，ＹＡＮＧ Ｈａｎ，ＹＵＡＮ Ｍａｏ－ｌｉｎ，ＨＥ Ｘｉａｏ－ｌｏｎｇ，ＲＥＮ Ｇｕｉ－ｍｅｉ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎ’ａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎ’ａｎ ７１６０００， Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｄｅｇｒａｄｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓｔａｃｋｅｄ ｃｏｗ ｄｕｎｇ ａｎｄ ｓｔｒａｗ ｆｏｒ ａ ｌｏｎｇ ｔｉｍｅ， ａｎｄ ｅｉｇｈｔ ｓｔｒａｉｎｓ （ＴＣ－２， ＴＣ－４， ＴＣ－５， ＴＣ－６， ＴＣ－８， ＴＣ－１１， ＴＣ－１２， ＴＣ－１３） ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ by Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ＨａｏＱｉＸｕｎ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒｌｙａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒｌｙａｓｅ ｏｆ ＴＣ－１１ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １．０ ＩＵ indicating ｔｈａｔ ＴＣ－１１ ｗａｓ ａ ｖａｌｕａｂｌｅ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ worth ｔｏ ｂｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ； ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ sｔｒａｉｎ； ＣＭＣＡ； ＦＰＡ
　　进入２１世纪以来，能源危机问题日趋严重。而大量的植物秸秆的主要成分――纤维素经过处理后可通过微生物发酵生产燃料、饲料、肥料等，取代目前由化工燃料合成生产的部分有机产品［１－３］。
　　纤维素的微生物降解已经取得了一定的成果［４－８］，但由于目前筛选得到的大多数纤维素降解菌产生的纤维素酶活力（CMCA）低下，成为制约该技术推广应用的重要原因之一。因此，筛选产生高活性纤维素酶的菌株有着重要的意义。本研究从陕北地区堆积秸秆和牛粪的土壤中筛选出可高效降解纤维素的菌株，对其进行酶活力测定，以期为解决秸秆转化醇类及菌肥的制造奠定科学基础。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１供试土样采自延安市宝塔区杨家湾长期堆积牛粪和秸秆的腐殖土。
　　１．１．２药品羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）、溴百里蓝、刚果红、3，5-二硝基水杨酸（ＤＮＳ）试剂，均为分析纯。
　　１．１．３仪器隔水式电热恒温培养箱（ＰＹＸ－ＤＨＳ－４０*５０－ＢＳ，上海跃进医疗器械厂）、紫外分光光度计（ＵＶ－１２４０，日本岛津）、立式压力蒸汽灭菌锅（ＬＳ－Ｂ５０Ｌ，江阴滨江医疗仪器厂）、气浴式振荡器（ＺＪＳ－１３２０，科大创新股份有限公司中佳分公司）。
　　１．１．４培养基ＰＤＡ培养基、ＬＢ培养基、ＣＭＣ培养基［９］、刚果红培养基［１０］、赫奇逊培养基［１１］、产酶培养基［９］。
　　１．２方法
　　１．２．１纤维素降解菌的筛选①富集：将土样加到ＰＤＡ液体培养基中，３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ，培养３ ｄ后取培养液以体积为５％的接种量接入ＰＤＡ液体培养基中，重复３次。②初筛：取０．５ ｍＬ富集液加入到ＣＭＣ培养基中，３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ，培养３ ｄ后划线分离，将得到的菌株转接在ＬＢ斜面上，４ ℃冰箱中保存备用。③复筛：将初筛的菌株接种到ＣＭＣ培养基上，选出长势较好的菌株接种于刚果红培养基上，选择透明圈大且清晰的菌株，接入经处理过的滤纸条［１２］的赫奇逊液体培养基中，２８ ℃、培养４ ｄ后，根据滤纸的裂解程度，选出引起滤纸裂解效果较好的菌株作为下一步的试验菌株。
　　１．２．２酶活力的测定①粗酶液的制备。取试验菌株培养液，以体积为５％的接种量接种于产酶培养基中，３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ、培养一定时间后，取适量培养液，４ ℃、５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，上清即为粗酶液。②酶活力定义及测定方法［１２］。酶活力定义：在ｐＨ值５．０、５０ ℃条件下，１ ｍＬ粗酶液在１ ｍｉｎ内水解ＣＭＣ－Ｎａ生成１．０ μｇ的葡萄糖，称为１个纤维素酶酶活力单位（μｇ／ｍｉｎ，ＩＵ）；相同条件下，１ ｍＬ粗酶液在１ ｍｉｎ内水解滤纸（经过去淀粉处理）生成1 μｇ葡萄糖，称为１个滤纸酶酶活力（ＦＰＡ）单位
　　（μｇ／ｍｉｎ，ＩＵ）。酶活力的测定：用ＣＭＣ－Ｎａ作底物，５０ ℃恒温水浴，粗酶液水解３０ ｍｉｎ，用ＤＮＳ法测定还原糖含量［１３］，利用还原糖的量来计算酶的活力。
　　２结果与分析
　　２．１纤维素降解菌的筛选
　　经过连续３次的富集、分离纯化，共得到１７株菌株；经刚果红培养基和赫奇逊培养基复筛后，选择在刚果红培养基上出现的透明圈大且清晰，在赫奇逊液体培养基中滤纸的裂解效果较好的８株产酶试验菌株，分别为：ＴＣ－２、ＴＣ－４、ＴＣ－５、ＴＣ－６、ＴＣ－８、ＴＣ－１１、ＴＣ－１２、ＴＣ－１３。
　　２．２酶活力测定结果
　　２．２．１ 纤维素酶酶活力由图１可知，在所有试验菌株中，ＴＣ－１１的ＣＭＣ酶活力最大，１２ ｈ时酶活力即达到所有菌株酶活力的最大值（０．９９ ＩＵ）；菌株ＴＣ－１３到２４ ｈ时酶活力达０．７８ ＩＵ；而菌株ＴＣ－２、ＴＣ－５、ＴＣ－８的酶活力变化不大，同时这３株菌株的酶活力均低于０．１９ ＩＵ；其余３株菌株的酶活力随培养时间的延长而缓慢增加。
　　２．２．２滤纸酶活力由图２可知，除菌株ＴＣ－２、ＴＣ－５、ＴＣ－８外，其余５株菌株的滤纸酶活力均呈现随培养时间的延长而增加的趋势，到６０ ｈ时ＴＣ－１１的酶活力最大，为１．０５ ＩＵ；ＴＣ－６、ＴＣ－１２和ＴＣ－１３的酶活力也较高，为０．57～０．７1 ＩＵ。
　　综合以上结果，菌株ＴＣ－１１产生的纤维素酶和滤纸酶都有较高的酶活力，因此，选择该菌株作为下一步制作菌肥、分解纤维素产醇等研究的试验菌株。
　　３讨论
　　１）在用刚果红培养基和赫奇逊培养基进行复
　　筛时，由于细胞没有裂解，胞内酶难以释放至细胞外，因此可能会把在胞内产纤维素酶的菌株淘汰掉，利用离心法得到的粗酶液也基本上为胞外酶。因此，本试验测定的酶活力主要为胞外酶的活性。

　　２）纤维素降解菌大多来自地表覆土，为好氧菌，本试验采用的是静置培养分解滤纸，试验得到的滤纸酶活力较低的菌株可能是由于缺氧，生长不佳所致，改变溶氧可能会使这些菌株的滤纸酶活力增强。
　　３）本试验仅是在固定条件下，对试验菌株产酶的情况进行了研究，而酶的产生和酶活力受诸多因素的影响。因此，得到的试验菌株的产酶条件还有待于进一步优化。
　　参考文献：
　　［１］ 李英． 高活性纤维素降解菌产酶条件和酶的性质及应用研究［Ｄ］． 成都：四川师范大学，２００５．
　　［２］ 刘翔，何国庆． 利用木素纤维素生产燃料乙醇的微生物代谢工程［Ｊ］． 粮油加工与食品机械，２００３（８）：６７－６９．
　　［３］ 史玉英，沈其荣，娄无忌，等． 纤维素分解菌群的分离和筛选［Ｊ］． 南京农业大学学报，１９９６，１９（３）：５９－６２．
　　［４］ 文少白，李勤奋，侯宪文，等． 微生物降解纤维素的研究概况［Ｊ］． 中国农学通报，２０１０，２６（１）：２３１－２３６．
　　［５］ ＷＯＯＤ Ｂ Ｅ， ＢＥＡＬＬ Ｄ Ｓ， ＩＮＧＲＡＭ Ｌ Ｏ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ａｓ ａ ｃｏｐｒｏｄｕｃｔ ｗｉｔｈ ｅｔｈａｎｏｌ ｄｕｒｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ＫＯＩＩ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， １９９７，５５（３）：５４７－５５５．
　　［６］ ＺＨＯＵ Ｓ Ｄ， ＤＡＶＩＳ Ｆ Ｃ， ＩＮＧＲＡＭ Ｌ Ｏ． Ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ＣｅＩＹ（ｃｅｌＹ） ａｎｄ ＣｅＩＺ （ｃｅＩＺ） ｉｎ ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｃａｃｙｔｏｃａ Ｐ２［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００１，６７（１）：６－１４．
　　［７］ ＸＩＡＯ Ｚ， ＷＡＮＧ Ｔ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ⅲ（ＥＧⅢ） ｇｅｎｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖａｓｉａｅ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２００１，４１（４）：３９１－３９６．
　　［８］ 吴显荣，穆小民． 纤维素酶分子生物学研究进展及趋向［Ｊ］． 生物工程进展，１９９４，１４（４）：２５－２７．
　　［９］ 夏金兰，张瑞永，张倩，等． 一株纤维素降解菌的分离、鉴定及降解特性初步研究［Ｊ］． 湖南师范大学自然科学学报，２００８，
　　３1（４）：８６－９０．
　　［１０］ 卢月霞，尹会兰，黄慧敏，等． 纤维素酶产生菌的筛选及其相互作用研究［Ｊ］． 河南农业科学，２０１０（１）：５９－６２．
　　［１１］ 高春，孟建宇，冯福应． 纤维素降解菌的分离筛选及酶活研究［Ｊ］． 畜牧与饲料科学， ２００８（４）：１７－２０．
　　［１２］ 魏桃员，张素琴，邵林广，等． 一株纤维素降解细菌的分离及特性研究［Ｊ］． 环境科学与技术，２００４，２７（５）：１－２．
　　［１３］ 王玉万，徐文玉． 木质纤维素固体基质发酵物中半纤维素、纤维素和木素的定量分析程序［Ｊ］． 微生物学通报，１９８７，１４（２）：８１－８４．

转载注明来源:https://www.xzbu.com/8/view-1067550.htm