桃腐烂病病原菌的分离鉴定

来源:用户上传      作者:

　　摘 要：目的：寻找引起屈家岭地区桃树果实腐烂病的致病微生物种类。方法：分别采用细菌培养通用培养基和PDA培养基，对采集自果林的腐烂的桃果实等样本进行微生物纯化，对各种微生物分离物进行形态观测，结合16rDNA序列分析和致病性测定，对致病微生物进行鉴定。结果：从病区采集到的各种样本经过多步分离纯化均发现了成团泛菌（Pantoea agglomerans），经室内致病性实验结果，证实该细菌能够使得桃果实腐烂。结论：造成桃果实腐烂的致病菌为成团泛菌（Pantoea agglomerans）。
　　关键词：桃果实;果实腐烂病;致病菌鉴定;形态学观察;16rDNA序列分析;致病性测定
　　中图分类号 S435 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）（02-03）-0098-03
　　Isolation and Identification of Pathogen of Peach Rot
　　Qu Xingwu et al.
　　（Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， China）
　　Abstract： Objective： to find out the pathogenic microorganism species causing peach tree fruit rot disease in qujialing area. [methods] bacterial culture medium and PDA medium were used to purify microorganisms from rotting peach fruits collected from fruit forests， and morphological observation was made on various microbial isolates. Pathogenic microorganisms were identified by combining 16rDNA sequence analysis and pathogenicity determination.  Results ： all kinds of samples were collected from the ward， Clumps are found through multi-step purification generic bacteria （Pantoea agglomerans）， through indoor pathogenic experiment results， confirmed that the bacteria can make TaoGuo real decay.  conclusion：TaoGuo real decay caused by bacterial pathogens are clouds generic bacteria （Pantoea agglomerans）.
　　Key words： Peach fruit; Fruit rot; Identification of pathogenic bacteria; Morphological observation; 16rDNA sequence analysis; Pathogenicity test
　　桃（Amygdaluspersica L.）为蔷薇科、桃属落叶小乔木，其果实味甜多汁，性甘味平，大多数人均可食用，且营养丰富，含蛋白质、糖、纤维素、脂肪、铁、磷、钙、胡萝卜素、维生素B1、有机酸等多种营养成分。湖北屈家岭地势较高，夏旱严重，近年来因地制宜大力发展桃树种植，有效地规避了当地严重的夏旱，取得了不错的经济效益，为当地农户增收脱贫、带动地区经济发展做出了突出贡献。
　　在生产中，桃果实可能会受到多种致病菌的侵染，引发多种病害，导致減产和降低商品性。2017—2018年，屈家岭管理区月宝山桃园种植基地有大规模软腐病的发生，导致叶片变黄、脱落，桃果实轻则品相变差，重则完全腐坏，导致桃农严重减产歉收。为此，笔者通过林间采样，对引起荆门屈家岭管理区桃果实腐烂病的病原菌进行了分离、鉴定，明确其种属，为病害生态防治提供依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 带病材料的采集 2019年5月12日，于荆门市屈家岭管理区月宝山桃园基地的桃林中，摘取有腐烂现象，或者有疤痕的桃果实新鲜桃果实病样，以及具有较多疤痕的病叶和病桃树根病桃树下土壤等放入采样袋中，带回实验室进行致病菌分离。
　　1.2 致病菌的分离及纯化 取具有明显腐烂症状的桃果实，用自来水冲洗干净表面的尘土，置于2%漂白粉溶液中消毒3min，用灭菌水冲洗3次后，放在灭菌后的滤纸上晾干。随后用无菌的解剖刀切取患病和健康交界处组织，摆放于牛肉膏蛋白胨固体培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，分别置于37℃和26℃的恒温培养箱中培养，24h后观察细菌的生长情况并记录。同时，在无菌环境下将取回的土样用无菌水进行梯度稀释，并取0.0001及以后2个梯度用灭菌过的移液枪枪头弯折后涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，分别置于37℃和26℃恒温培养箱中培养，24h后观察细菌的生长情况并记录，48h后观察真菌生长情况，发现在病健交界处组织的PDA平板中未见明显的真菌生长情况，无法分离得到真菌。将分离得到的疑似致病菌分别用灭菌过的移液枪枪头弯折后涂布转代接种至牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上进行纯化，待菌落生长至直径1～2cm，挑取细菌，转接至锥形瓶，37℃摇瓶培养24h后，用无菌枪头吸取适量菌液，进行革兰氏染色后，置于光学显微镜下用油镜观察细菌态并拍照记录。 　　1.3 疑似病原菌的致病性测定 选取疑似病原菌的培养液进行桃果实的离体接种试验，观察并记录接种后的发病症状，并从发病部再次分离纯化病原菌，完成柯赫氏法则的验证。室内离体接种：取新鲜健康的桃果实，洗净后，用2%漂白粉溶液消毒3min，再用灭菌水冲洗2次，后置于铺放了灭过菌的滤纸的烧杯内，用无菌移液枪吸取50μL菌液打入桃果实内，以等量的灭过菌的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，每个疑似致病菌接种4个桃果实，2次重复;置于恒温培养箱中以37℃培养并观察桃果实是否腐烂。
　　1.4 致病菌的DNA提取 用试剂盒法进行致病菌DNA的提取：将纯化后的病原菌，接种至细菌培养通用培养基中进行培养，37℃摇瓶培养24h，待培养基明显变浑浊时，取细菌培养液2mL于干净的离心管中，10000r离心1min，吸净上清液。向菌体沉淀中添加200μL缓冲液GA，振荡至菌体全部悬浮。再向管中加入20μLProteinaseK溶液，混匀。用移液枪吸取240μL缓冲液GB加入管中，振荡15s，70℃水浴加热10min，待液体变澄清后，离心15s后向管中添加200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s等到出现沉淀后离心15s。将上步所得液体和沉淀都到入1个干净的吸附柱CB3中，将吸附柱插入1个干净的收集管中，12000r离心30s，弃去收集管中的废液不要，再重新把吸附柱CB3插入收集管中。向CB3中加入适量的（600μL）缓冲液GD，12000r离心45s，倒掉收集管中的废液不用，再重新将吸附柱CB3插入收集管中。向吸附柱CB3中加入适量（600μL）的漂洗液PW，12000r离心30s，倒掉收集管中的廢液，再将吸附柱CB3插入收集管中。再将上一步重新再做1遍后将吸附柱CB3重新插回收集管中，12000r离心2min，弃去收集管中的液体不要。再将吸附柱CB3放在一边10min，让吸附柱中残留的漂洗液充分的挥发出去后再将吸附柱CB3插入全新的离心管中，用移液枪在吸附膜的正中间悬停加入200μL的洗脱液TE，再放在一边5min后，12000r离心2min，将所有的液体集中到离心管中。再对所提DNA进行纯度测定，并保存备用。
　　1.5 PCR扩增、16rDNA序列测序和分析 利用细菌鉴定通用DNA引物27F/1492R，对分离鉴定提取得到的病原菌的DNA进行扩增（序列分别为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），扩增程序为：预变性97℃，20S;退火51℃，60S;延伸70℃，110S，循环35次;最后70℃，保温15min。扩增得到的DNA产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，利用EB进行染色后利用凝胶成像系统进行观察并拍照后选取扩增条带清晰，大小在1500bp左右的PCR产物（图1），切下进行胶回收后，送到武汉擎科生物科技有限公司进行序列测定。
　　2 结果与分析
　　2.1 致病菌的形态学 调查中选取发生腐烂的桃果实，小心摘下，发现病桃果实与健康桃果实相比，病桃果实明显多处出现褐色病斑，且有明显的软化流水现象（图2）。选取具有代表性的病桃，病叶和树下土壤，以及健康桃果实，将病桃，健康桃和病叶经表面消毒摆放于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，树下土壤经震荡摇匀梯度稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，培养12～24h后挑取分离较好的病原菌菌落转到新的牛肉膏蛋白胨平板上进行纯化培养，从上述培养基中都纯化得到细菌分离物2个。根据病原菌菌落形态，可将2株疑似病原菌分为A、B2类，A类疑似病原菌1株，菌落呈圆形点状，偏乳白色，表面湿润易挑取;B类疑似病原菌1株，菌落椭圆形，偏黑色或褐色，颜色较A类更深，表面湿润易挑取（图3）。
　　2.2 疑似致病菌的致病性 室内致病性测定显示，接种疑似致病菌B的桃果实未出现明显发病症状，接种后5d，仅在接种点伤口周围略有变色，无明显的褐化、流水、软化现象，与无菌水和仅培养基处理的相同（图4）;接种疑似致病菌A的桃果实出现了明显的腐烂症状，病斑呈褐色，而且有明显的流水现象（图5）。依据室内致病性测试结果可知，B类疑似致病菌分离物不是造成桃果实腐烂病的致病菌，A类致病菌分离物才是桃果实腐烂病病的致病菌。对A菌经革兰氏染色，并于油镜下观察得知该菌为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状（图6）。
　　2.3 分离物16rDNA序列的测序结果 使用细菌16rDNA通用引物27F和1492R对分离得到的致病菌的DNA进行扩增，得到长度为1500bp左右的条带，测序后上传至NCBI进行BLAST比对，该细菌的16sDNA与成团泛菌（Pantoea agglomerans）具有高度的同源性，相似性达99.4%。结合形态学观察可以确定该菌为成团泛菌。
　　3 结论
　　通过对采集自果园的腐烂桃果实等样品进行病原物分离、纯化和鉴定，利用16sDNA法结合形态学观察，并通过室内的致病性试验，确定引起屈家岭管理区桃果实腐烂的病原物为成团泛菌。由于该菌为革兰氏阴性菌，故在日常防治中可以在发病初期采用对革兰氏阴性菌杀灭效果较好的生物农药进行防治。
　　（责编：张宏民）
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15119573.htm