棕色固氮菌分离鉴定与初步应用研究

来源:用户上传      作者: 杨茂生 裴晓红 朱冠群 梁应林 熊如秀

　　摘要棕色固氮菌分离鉴定与初步应用研究结果表明，通过分离培养和鉴定，分离出的6个棕色固氮菌贵州地方株，其中4株有一定固氮能力，另外2株固氮能力较强。应用棕色固氮菌制成菌肥，可以显著提高黑麦草产量。
　　关键词棕色固氮菌；分离鉴定；初步应用
　　中图分类号S144.5文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）11-0049-02
　　
　　StudyonIsolationandIdentificationandPrimaryApplicationofAzotobactervinelandii
　　YANG Mao-sheng 1PEI Xiao-hong 1ZHU Guan-qun 1LIANG Ying-lin 1XIONG Ru-xiu 2
　　（1 Animal Husbandry and Veterinary Medicine Institute of Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550005； 2 Gujiao Animal Husbandry and Veterinary Medicine Station in Longli County）
　　AbstractIsolation and identification and primary application of Azotobacter vinelandii were studied. The results showed that through isolation，culture and identification，6 strains of Azotobacter vinelandii were obtained. Among them，four strains had certain nitrogen fixation ability，and other two strains were even better． Using Azotobacter vinelandii，the bacterial fertilizer was made，and it significantly increased the yield of ryegrass.
　　Key wordsAzotobacter vinelandii；isolation and identification；primary application
　　
　　棕色固氮菌属于自身固氮菌，不仅能在土壤中自行繁殖，固定空气中的游离氮，而且能产生藻聚糖（Alginates），棕色固氮菌染色体有4种基因对藻聚糖的生物合成与调节起作用。这种细菌产生的藻聚糖与海藻酸盐具有相似的功能和作用，可作外科敷料、牙模、食品及药物缓释剂等用途，或是用作固定化酶和细胞工程等方面[1-2]。国内研究发现海藻糖能提高绵羊红15号小麦幼苗耐盐能力[3]；海藻糖可以提高大豆植物抗性[4]。
　　为了立足于贵州省的自然条件，提高产草量和载畜量，推行舍牧相结合的山羊养殖技术，合理有效地利用当地山林、草山草坡及冬闲农田等自然资源，促进畜牧业增产，维护生态平衡，特在贵州省龙里、天柱、麻江、丹寨、平坝、毕节等县（市）开展牧草种植、饲养管理和疫病防治试验[5-6]。同时，重点对棕色固氮菌资源、分离培养鉴定、藻酸盐提取、菌肥生产工艺和推广试验进行研究，推动种草养羊业的发展。现将棕色固氮菌分离鉴定与初步应用研究情况报告如下。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　1.1.1供试土样。采集黑麦草和其他非豆科植物根际土壤土样（土壤溶液pH值为6.5~7.2）。
　　1.1.2供试试剂。无氮源培养基；结晶紫。
　　1.1.3试验仪器与设备。紫外光分光光度计；台式高速冷冻离心机（德国）；凝胶成像分析系统；核酸电泳系统；酸度计（德国）；超纯水器（10 L）；控温、控湿全自动生化培养箱；卧式高压消毒柜；欧林巴氏显微镜系列（摄影显微镜、光学显微镜、莹光显微镜、倒置显微镜）；超静工作台（单人双面）以及其他常规仪器设备。
　　1.2培养基配制及分离鉴定方法
　　1.2.1富集培养。蔗糖15 g，硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾0.8 g，氯化钠0.2 g，碳酸钙1 g，质量分数为10%的钼酸钠、硼酸、硫酸锰、硫酸亚铁（现配）水溶液各1 mL，水1 000 mL，pH值为6.5～7.2，在250 mL三角瓶中，每瓶分装30 mL，灭菌备用。取3～5 g土样用50 mL水制成混浊液，吸取5 mL悬浮液装入盛有30 mL富集培养液的250 mL三角瓶中，100 r/min离心，28 ℃，培养3～5 d后，换新鲜培养基继续培养，重复4～5次后，稀释分离。
　　1.2.2平板分离培养。在富集培养基中加入2%琼脂制成平板分离培养基，灭菌后，倒入无菌培养皿中备用。取富集培养后的培养液，稀释涂布于平板分离培养基。于28 ℃培养2 d后，将在稀释度较大的平板上，生长较大的菌落移入斜面。
　　1.2.3镜检。取灭菌的载玻片，在载玻片中央滴1滴无菌水。然后在火焰旁，用灭过菌的接种环从培养基上挑取少许黏液涂在载玻片的水滴中，加1滴结晶紫染液，染色1 min，让涂片自然干燥；依次在低倍镜和高倍镜下观察，可以看到染成紫色的自生固氮菌。仔细观察各种自生固氮菌的形态和大小。
　　1.3棕色固氮菌生化鉴定
　　取淀粉、甘露醇、鼠李糖、乳糖、硝酸盐、过氧化氢酶、钼酸盐等，取2只生化微量鉴定管接种培养物，于恒温箱中培养24~36 h。
　　1.4固氮酶活性测定
　　用微量凯氏定氮法计算含氮量，计算公式如下：
　　EA2（mg/L）=（V1-V2）×14×1 000/V
　　式中，V1为样品滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液体积（mL）；V2为空白滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液体积（mL）；V为发酵液样品体积（mL）。
　　1.5棕色固氮菌的生产工艺研究
　　1.5.1棕色固氮菌的富集培养。取牧草根际土壤土样棕色固氮菌样品经分离培养后的保存菌种，通过菌种的筛选在平板培养基上和富集培养基培养。然后于三角瓶摇床振荡培养。
　　1.5.2棕色固氮菌的发酵。通过发酵设备和发酵培养条件的建立，使棕色固氮菌在发酵罐中进行一级发酵罐培养和二级发酵罐培养。
　　1.5.3棕色固氮菌菌肥的配制。收集棕色固氮菌培养物，并进行菌数检查和稀释备用。然后用草炭或其他载体处理与搅拌，称量配料，封存，包装，待用。
　　1.6棕色固氮菌菌肥对黑麦草的影响
　　从土壤中分离棕色固氮菌。通过分离、富集培养和发酵制成含色固氮菌的菌肥，使用时再按1∶300比例与基肥配合使用。一年生黑麦草多选用贵州省常用的“特高”品种；农家肥用腐熟农畜粪。以贵州省畜牧兽医研究所试验地和龙里县养羊基地为主要观测地点，设3个处理：棕色固氮菌＋基肥、农家肥和不施肥。每个处理分2次种植一年生黑麦草100 m?2。推广应用地点主要为龙里、天柱、丹寨、毕节等县市。推广试验总面积逾66.67 hm?2。

　　2结果与分析
　　2.1棕色固氮菌鉴定结果
　　通过调查、土壤样品收集、细菌分离培养、生化鉴定，已分离出棕色固氮菌贵州地方株。该菌经过3~4 d后，取出培养皿，观察发现培养基上长出菌落及其培养物黏液。黏液初为无色透明，以后为乳白色，最后变成褐色，里面含有自生固氮菌。显微镜下其形态结构为短杆状，周身鞭毛，革兰氏染色阴性。大小（0.8~1.0）μm×（2.0~3.0）μm。最适温度25~30 ℃，最适pH值6.5~7.2。营养琼脂平板上形成白色扁平，边缘不整齐，生长良好的菌落。无氮平板上菌落平滑，有光泽或粘稠，透明，生长有限，无色，菌落较小。淀粉试验阴性，甘露醇发酵阳性，鼠李糖发酵试验阴性，乳糖发酵试验阴性，硝酸盐还原阳性，过氧化氢酶试验阳性，钼酸盐试验阳性，明胶穿刺液化，石蕊牛奶变清。
　　2.2固氮酶活性测定结果
　　从非豆科作物根际土壤中分离到6个棕色固氮菌地方菌株，将菌株接种到无氮培养液中，28 ℃，100 r/min培养5~7 d后，用微量凯氏定氮法测定其固氮酶活性。4株有固氮能力（含氮量1～10 mg/mL），2株固氮能力较强（含氮量＞10 mg/mL）。均产生黏液，内含藻酸盐。
　　2.3固氮菌肥应用效果
　　通过分离培养制成含量为棕色固氮菌菌数为5亿~8亿个/g，其中活菌数为100万个/g的菌肥备用，使用时再按1∶300的比例与基肥配合使用。牧草产量得到提高，其中稻田种植黑麦草年产由上一年产量67.5~75.0 t/hm?2提高至当年产量75.0~82.5 t/hm?2。通过贵州山区小流域牧草种植及其在养殖上的效果比较分析，种草养羊户经济收入增加，种草养羊业整体上得到较快发展。
　　3结论与讨论
　　研究结果表明，从黑麦草和其他非豆科植物根际土壤中可以成功分离出棕色固氮菌贵州地方株。微量凯氏定氮法测定其固氮酶活性结果表明，6个棕色固氮菌贵州地方株中，4株有一定固氮能力，另外2株固氮能力较强。从1990年以来，国内外众多学者对棕色固氮菌藻酸盐基因和固氮酶基因进行了分析研究[7-20]。目前，通过引物设计和模板制备建立针对棕色固氮菌固氮酶基因和藻酸盐algE、algJ等基因的PCR方法具有较高的适用价值。PCR的优点是可以提高检验效率、降低费用，同时具有灵敏度高、快速、专一性强和自动化特点。因而在总结前人经验、借鉴传统方法和同类先进水平基础上，创新设计PCR检测技术和其他分子生物学方法可提高棕色固氮菌地方株的检出率，针对性地利用各类固氮菌菌种。因此，今后的研究可以采用PCR方法进一步进行色固氮菌的检测，以提高其检出率。由于棕色固氮菌肥属于生物制剂，能固定空气中的氮，可间接提高土壤肥力，不会对土壤造成污染，利于环保。荒坡、冬闲田土种草养畜现也已成为贵州省一个不可缺少的畜牧生产内容。棕色固氮菌菌肥配合农家肥施用，对一年生黑麦草达到增产效果，黑麦草产量由67.5～75.0 t/hm?2提高至75.0~82.5 t/hm?2。对贵州省种草种草养畜发挥积极作用。
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