一种新型抗真菌化合物的分离鉴定
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摘要：本研究从具有广谱抗菌活性的链霉菌XB-D液体培养物中分离纯化得到了一种抗真菌的化合物。通过质谱、核磁共振和气相色谱法对得到的抗真菌化合物的完整共价键结构进行了解析。分析得知该化合物的分子量为1215.518Da。通过气相色谱发现有一个木糖基连接在该化合物上。核磁共振图谱显示该化合物是一个由八个氨基酸组成的多肽。经测定，化合物对很多病原真菌均显示出很强的拮抗效果。
一、引言
链霉菌XB-D是从土壤中分离得到的一株具有广谱抗真菌活性的放线菌。鉴于病原菌对现有抗真菌剂的抗药性日益增强，医疗领域对新型抗真菌剂的需求在不断增长。链霉菌的许多菌株有一个突出的特点是能够产生很多种抗真菌的物质，使得这些菌株具有了研发新型药物的潜力。
本研究鉴定了一种新抗菌化合物的结构并研究了其抗菌活性。通过质谱、核磁共振和气相色谱分析，得到了该物质的完整共价键结构，检测了该化合物的对一系列病原真菌的抑制作用。本试验为进一步了解该化合物的作用方式以及研究其在制药领域上的应用潜力打下了坚实的基础。
二、材料方法
1.药品试剂
所有的药品试剂除非特别说明，均为最高纯度等级。
培养基采用PDA加富培养基：土豆200g，葡萄糖20g，氯化钠5g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾2g，水1L。固体加2%（w/v）琼脂。
2.抗真菌物质的分离纯化
链霉菌XB-D接种至上述培养基中，30℃摇床发酵20h。100℃灭活10min，离心取上清，每L发酵上清液加入50g大孔吸附树脂LQ8，震荡吸附0.5h后，用75%的甲醇解吸。解吸液浓缩后利用高效液相色谱进行精制。流动相采用甲醇和水（45: 55）。收集各分离峰进行抗真菌活性检测。对有活性的峰进行大量收集制备，活性物质浓缩干燥后进行结构鉴定。
3.抗菌物质的结构鉴定
3.1质谱分析
利用Q-TOF II质谱仪对抗真菌活性化合物进行了电喷雾质谱分析。将带测物质溶于为含0.1%甲酸的50/50乙腈/水（v/v）中，流速1μL/min，流出物经纳米液相接口喷雾。通过串联质谱对单电荷离子进行分析。
3.2气相色谱分析
通过气相色谱法，对纯化后的活性物质中的单糖组分进行了分析。气相色谱仪配备有内径0.22mm的熔融石英柱和电子捕捉检测器。单糖标样（戊糖，己糖，N-乙酰氨基己糖）与被测物质同时进行检测，化合物中的单糖组成通过与标样的层析图谱进行比对获得。山梨醇作为内标。
3.3核磁共振分析
通过核化学位移全相关谱（TOCSY）、二维NOE增强谱（NOESY）、旋转框架奥佛豪斯效应谱（偶极偶合影响光谱ROESY）、异核单量子关系C13二维核磁共振图谱（13C HSQC 2D NMR）对该化合物的详细结构进行解析，具体解析及解谱工作由内蒙古肿瘤医院测试中心完成。
3.4抗菌效果研究
测试病原真菌有烟曲霉、黑曲霉和须发藓菌等，由内蒙古医学院提供。利用琼脂稀释法测定了最小抑菌浓度。用无菌水将纯化后的化合物连续2倍稀释，加入平底的12孔板中，每孔加入1毫升的葡萄糖琼脂胰胨。琼脂凝固后，倒置放置于4℃下直到使用。真菌接种在沙氏琼脂平板上，22℃培养7天，打孔器取下菌块放入3毫升磷酸缓冲液中磨碎。每孔加入5μL的匀浆上清液，晾干，22℃培养。除须发藓菌培养72小时外，其他真菌均培养48小时候测定，取肉眼看不到真菌生长的最小浓度值作为其最小抑菌浓度。
三、结果与讨论
1.化合物结构解析
高分辨率色谱显示该抗真菌物质的分子量为1215.518Da。经鉴定，该化合物由以下8个氨基酸组成：天冬酰胺-赖氨酸-色氨酸-β-羟基酪氨酸-赖氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-丝氨酸。1号和7号氨基酸残基具有天冬酰胺的化学位移特征。2号赖氨酸残基的结构类似于脱氨基赖氨酸，推测其可能是由决定该化合物的基因表达的酮缩酶和转氨酶合成的。通过分析该区域的化学位移可知，2号位与木糖基之间由有一个四碳的羰基链连接。试验数据证实酰基链连接于2号氨基酸的4号碳而木糖基连接于其2号碳。3号氨基酸残基与色氨酸残基的化学位移特征相同。从吲哚环上的质子到色氨酸的2号位质子再到化合物的其他氨基酸残基的NOE数据位空白，这说明色氨酸环在溶液中是自由旋转的，以致得不到信号。其含有色氨酸吲哚环的进一步证据是信号中缺乏色氨酸的NH共振。当吲哚环暴露在酸性水溶液环境下，NH质子交换加速，致使谱线加宽而信号丢失。4号氨基酸残基是一个修饰了的酪氨酸残基，2号位有一个羟基化的碳，导致2号位质子有一个5.16ppm的明显迁移。从芳香环4号碳到β-羟基酪氨酸的2号位质子观察到了NOE信号，明确了芳香族质子频率的分布。5、6和8号氨基酸残基分别是典型的赖氨酸，甘氨酸和丝氨酸。
2.该化合物具有广谱抗真菌活性
通过检测发现，该化合物对一系列病原真菌均显示出较好的抑制作用。能够引起侵染性肺曲霉病的烟曲霉和黑曲霉均对该物质高度敏感，最小抑菌浓度分别为8μg/mL和4μg/mL。须发癣菌可引起脚气病，该化合物对其的最小抑菌浓度4μg/mL。这些数据表明该化合物可以作为一种广谱抗真菌剂应用于动植物病原真菌防治方面。
四、结论
本研究阐明了一种新型化合物的完整共价键结构，测定了该物质的广谱抗菌活性。结构鉴定确认了该化合物是一种新的抗真菌物质,通过核磁共振图谱和详细的结构解析，我们发现了该化合物的具体骨架构成证实了这是一种糖肽。通过抗菌试验我们发现，该化合物对常见的几种病原真菌均有很好的抑菌效果。
参考文献：
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