一例蛋鸡空肠弯曲杆菌的分离与鉴定
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摘要：鸡弯曲杆菌性肝炎又称鸡弧菌性肝炎，是由空肠弯曲杆菌（又称弧菌）侵害鸡的肝脏、脾脏、肾脏等内脏器官而引起的一种细菌性传染病。本研究对采集疑似患弯曲杆菌性肝炎的病鸡肝脏进行空肠弯曲杆菌分离鉴定，并分析了该分离菌株抗生素敏感性，为有效控制此次空肠弯曲杆菌污染提供了科学依据和技术支撑。
关键词：蛋鸡;空肠弯曲杆菌;分离;鉴定
中图分类号：S858.31 文献标识码：B文章编号：2095-9737（2019）11-0021-02
不同日龄的鸡群都可感染空肠弯曲杆菌，但开产前后更易感染发病，雏鸡感染后死亡率高，成年鸡死亡率较低，但耐过鸡生产力降低。病鸡多出现肝脏肿大充血、坏死、变性等病理变化。病鸡和带菌鸡是该病的主要传染源，健康鸡主要通过消化道感染。通常鸡弯曲杆菌性肝炎多呈散发性流行，饲养管理不当或治疗不及时常继发感染其他疾病，导致发病率、死亡率升高，造成严重的经济损失，同时空肠弯曲杆菌被认为是引起人类腹泻的常见病原菌之一，而其主要来源是禽肉产品，因此作为日益严峻的食源性疾病也威胁着公共卫生安全。
1 发病情况
2018年7月，青海省西宁市某蛋鸡养殖场发生疑似鸡弯曲杆菌性肝炎的疫情，最初在产蛋初期软壳蛋、砂壳蛋产出较多，但产蛋率可保持正常水平，到了产蛋中期产蛋率显著下降，发病率也有显著增加，大部分发病鸡食欲下降、精神不振、双眼无神、腹泻、排黄白色水样稀便，并伴随零星鸡死亡的情况，病死鸡多鸡冠苍白、腹部增大。
2 临床剖检
随机取20只病死鸡进行病理剖检，发现腹腔内有大量红色腹水，肝脏肿大质脆、边缘钝圆、表面有黄白色坏死灶，脾和肾苍白肿大、有针尖大小的出血点，心肌苍白、心冠有出血斑点，有的病鸡小肠黏膜有充血、出血，盲肠淋巴充血，有的病死鸡卵巢变性、卵泡破裂。无菌条件下采集病死鸡的肝脏组织进行病原菌分离。
3 分离培养
将肝脏病料接种于改良CCDA选择性培养基上，置于10%浓度CO2恒温箱中42℃培养 36 h，在培养基表面出现边缘整齐、圆形、有金属光泽的小菌落。将分离菌和病死鸡肝脏经革兰氏染色后，镜检均可见革兰氏阴性弯杆菌，呈逗点状、螺旋状或S状。
4 PCR鉴定
采用双重PCR对分离菌株进行鉴定，引物分别参照弯曲杆菌属16S rRNA和空肠弯曲杆菌mapA基因序列设计，P1：5'-ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC-3'，P2：5'-GGACGGTAACTAGTTTAGTATT-3'，目的条带为857bp;F1：5'-CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG-3'，F2：5'-GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA-3'，目的条带为590 bp。
用挑取CCDA平板上的典型可疑菌落加入200 μL超纯水中混匀，沸水煮沸10 min，取出立即置于冰上，10000 r/min离心5 min，取上清做PCR鉴定的模板。
PCR反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 10 μL、两对上下游引物各0.5 μL、模板1 μL，补灭菌水至20 μL，同时设立阴性对照，反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR反应产物用1%的琼脂糖凝胶板电泳后，用凝胶成像仪进行成像分析，结果与预期相符。根据发病情况、临床症状、病理变化、实验室检查等，最终确定该蛋鸡场感染了空肠弯曲杆菌。
5 药敏试验
根据该蛋鸡养殖场日常的用药情况，选择常用的氨苄西林、阿莫西林、头孢噻肟、头孢曲松、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、诺氟沙星、环丙沙星、红霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、氟苯尼考、磷霉素、多黏菌素B、多西环素共计17种抗生素进行药物敏感性试验，药敏试验按照美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准进行操作及判定。将菌液稀释到一定浓度均匀涂布到CCDA平板上，将选定的药敏片贴到平皿上合适的位置后，42℃微需氧培养48 h，根据各药敏片的抑菌圈直径判定药物的敏感性，結果分离菌对头孢噻肟、头孢曲松、环丙沙星敏感，对氟苯尼考、磷霉素中敏，对多西环素低敏，其余均耐药。
6 毒力测定
将典型菌落纯化后的菌液接种到10枚8日龄鸡胚卵黄囊内，0.2 mL/枚，置于37℃温室内继续孵化。结果第三天死亡4枚，第四天死亡5枚，第五天死亡1枚，死胚均出现胚体出血、肝脏坏死症状。收集死胚的尿囊液，经革兰氏染色、镜检，发现有呈螺旋状、S型的阴性菌;将采集的病鸡肝脏、脾脏等组织进行研磨后和收集的尿囊液混合，用适量的灭菌生理盐水制成悬液，通过口服的方式接种6只18周龄健康蛋鸡，结果在48 h内均发病，且临床症状、病理剖检和革兰氏染色等结果同养殖场病鸡相同。
7 结论
本研究从疑似感染空肠弯曲杆菌的蛋鸡养殖场采取病料，通过剖检、细菌分离鉴定等相关实验研究，最终确诊了该养鸡场疫情为鸡弯曲杆菌性肝炎，并结合药敏试验，对临床用药给予了科学的指导，选择高敏抗菌药物进行治疗后，疫情得到了有效的控制。
目前空肠弯曲杆菌是最为常见的一种食源性致病菌，在家畜家禽等动物体内普遍存在。研究发现鸡是最易携带空肠弯曲杆菌的动物，开产前后的蛋鸡最容易发病，多呈散发或地方性流行。
我国作为禽类的养殖大国，禽类产品在消费品市场占有很大的比例，人类感染空肠弯曲杆菌的主要途径就是食用了污染的禽类产品，一旦感染将导致腹泻、关节炎和格林-巴利综合征等疾病，严重危害公共安全，因此应加强从养殖场到百姓餐桌的空肠弯曲杆菌的监测工作。
临床上鸡弯曲杆菌性肝炎常与其他疾病如大肠杆菌病、支原体病、沙门氏菌病等发生混合感染，致使发病鸡群的病死率显著提高，严重损害养鸡业的经济效益，综上所述在养殖过程中有效防控空肠弯曲杆菌具有重要的现实意义。
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