仔猪大肠杆菌的分离鉴定及市售药物比较

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　　摘 要：采用常规方法从猪场分离仔猪大肠杆菌，在10份样中分离出8株致病大肠杆菌。血清型鉴定表明：8株大肠杆菌血清型属于O138。用K-B法用进行10种抗生素耐药性检测。药物敏感性试验表明，头孢噻肟CTX，丁胺卡那KAN，呋喃妥因NFT敏感;对多粘菌素PMB9。0%，对阿莫西林AMX72。7%，氨苄青霉素AM81。8%，氯霉素C63。6%，氧氟沙星OFX45。4%，环丙沙星CIP54。5%，青霉素PG90。9%均有不同程度耐药性。8株中耐药大肠杆菌最少耐4种抗生素，最多耐7种。对8种产品药物进行微量肉汤抑菌结果表明：乙酰甲喹预溶剂3， 痢菌净预混剂抑菌效果好。
　　关键词：致病性大肠杆菌 ;血清型鉴定;耐药试验;  微量肉汤抑菌
　　一、材料与方法
　　1.材料
　　（1）病料采集
　　用棉拭子蘸取患仔猪黄痢的仔猪肛门或直肠粪便， 采10份样。
　　（2）主要培养基
　　伊红美兰培养基，麦康凯培养基，三糖铁培养基购自浙江微生物试剂有限公司; 普通平板、普通肉汤。
　　（3）主要试剂和材料
　　定型血清 大肠杆菌O抗原单价血清，微生物生物实验室。蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖等及药敏片等均购自杭州微生物试剂有限公司;蛋白胨水溶液、甲基红试剂、V- P 试剂按卢中华的方法配制。
　　（4）主要仪器
　　高倍显微镜、 冰箱、电子天平、  高速台式离心机、摇床。
　　（5）对照菌株
　　实验所用对照菌株为大肠杆菌：1515（C83646引起仔猪黄白痢，血清型O149K88）;1496（C83524引起猪水肿病，血清型O78K80），沙门氏菌cvcc533（血清型C79-13）。
　　2.8种市售药物比较
　　由于细菌的耐药谱比较广，同时市场上有许质量各异的多种药物，为更好的防控该病，对市场上的常用8种药物进行了抑菌试验。
　　（1）药物选择
　　乙酰甲喹预溶剂3种，分别代号为YXJ1，YXJ2，YXJ3;痢菌净预溶剂1种， 代号为LJJ;痢疾肠炎宁1种， 代号为LJC;止痢散1种，代号为ZLS; 白头翁散1种，代号为BTW; 氟哌酸1种，代号为FPS。
　　（2）主要试剂和材料
　　96孔V -型血凝板培养基 麦康凯培养基、营养肉汤按使用说明配制，杭州微生物试剂有限公司。MH 肉汤， 按100 mL 肉汤， 加1 g 葡萄糖，0。1 mL溴甲酚紫的比例配制稀释用培养基。
　　（3）对照菌株
　　同上。
　　3.分离鉴定方法
　　（1）细菌分离及染色镜检
　　细菌分离 将采样肛门棉拭子，分别接种麦康凯琼脂平板上，37℃培养18～24 h，生长情况、形态和颜色。并用革兰氏染色法染色，油镜检查。见附一
　　（2）纯化培养
　　从麦康凯琼脂平板上挑取单个砖红色菌落接种于伊红美兰琼脂平板上，37℃培养18～24 h，然后移植于普通琼脂培养基上培养。
　　（3）生化试验
　　①糖发酵试验。参考兽医微生物学实验指导的方法进行，将各菌株分别接种在蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳酸等糖发酵生化管中，置于37 ℃恒温箱中培养24 h，并记录结果。
　　②其它试验。参考兽医微生物学实验指导的方法进行，将各菌株分别做三糖铁试验，柠檬酸试验、吲哚试验、甲基红试验、V- P试验（IMViC试验），运动力试验，并记录结果。
　　（4）致病性试验
　　将上述生化反应已鉴定为大肠杆菌的菌株分别接种于普通肉汤，37 ℃培养18 h 后备用。取62只健康小白鼠随机分为30组，每组2只，另取2只设为对照组;试验组每只小白鼠腹腔接种注射0。2 ml肉汤培养物，对照组注射无菌肉汤。两组隔离饲养观察，每8h观察小白鼠的情况，并详细记录。
　　（5）O血清型鉴定
　　将纯化的待检菌液涂布于普通琼脂平板上，于37 ℃恒温箱中培养18 h 后，用适量5 g/ L 石炭酸生理盐水洗下菌苔，制成浓稠菌悬液;121 ℃高压2 h ，破坏K 抗原后即为待检菌的O 抗原;取制备的待检菌O 抗原及大肠埃希菌O 抗原定型血清各20μL ，在玻板上混匀，30 s 内出现明显凝集现象者为阳性反应。同时以制备的待检菌O抗原与石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝集现象。
　　（6）药敏试验
　　试验方法严格按照美国临床实验室标准委员会（National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS） 推荐的K-B法进行。在营养琼脂平板上挑取单个菌落接种于2mL 普通肉汤管内，37℃培养16～18h后，用MH 肉汤调制菌悬液，使其达到0。5麦氏比浊管浊度或用菌落计数为108CFU/ml。
　　4.市售药物比较--微量肉汤稀释法
　　按照药物使用说明将药物稀释，同一类药物不同厂家的药物稀释到同一浓度。中药制剂水煎熬制，水浴浓缩到1g/ml。
　　微量肉汤稀释法 微量稀释板的第1～ 12 孔中加入50μLMH 肉汤， 第1孔中加入50μL 一定濃度的药物。从第1 孔开始至第11 孔作倍比稀释， 并从11 孔中弃去50 μL ， 第12 孔做阳性对照。每一孔中加入含108CFU/ml 分离出的大肠杆菌MH 肉汤培养物50 μL， 在第12孔中加入50 μL 标准质控菌。振荡混匀。35℃培养16～ 20 h。用分离大肠杆菌做两次重复，用标准质控菌1515做对照。观察细菌生长情况。如果有细菌生长，则大肠杆菌利用培养基中的葡萄糖，产酸从而使pH降低，指示剂溴甲酚紫颜色发生改变。培养物为黄色表明有细菌生长， 蓝紫色没有细菌生长。细菌生长完全被抑制的最高稀释浓度为最小抑菌浓度（M IC）。
　　二、总结讨论
　　饲料中添加低剂量的抗生素， 可以有效预防和控制某些病原菌的感染， 提高畜禽生产性能。据估计， 美国这类用途的抗生素占总量40% ， 其中大部分用于养猪生产。由于某些抗生素的长期和不合理使用，临床耐药菌株不断增加， 耐药性不断增强， 给疾病的治疗带来了严重后果， 也为人类健康带来了深远影响。
　　由于大肠杆菌易产生耐药性，临床用药时建议以药敏试验结果为依据。养猪场必须加强饲养管理和卫生消毒措施，减少大肠埃希菌病的发生，并应定期对从本场分离的菌株进行药物敏感性监测，在兽医指导下选择敏感性药物有目的地控制大肠埃希菌病，避免因滥用药物造成耐药菌株产生而导致治疗无效。在药物治疗的同时，还应注意配合补液、收敛等对症疗法以提高治疗效果。
　　参考文献：
　　[1]蔡宝祥.动物传染病诊断[M].南京：江苏科学技术出版社，1993：280～288.
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