一株猪链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究

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　　摘要 为了确定扬州市某猪场发病猪的病原，对该猪场送检的病猪心脏进行了细菌分离与培养。通过16S rDNA测序和gdh基因PCR扩增，确定细菌种类;用血清型特异性引物进行PCR扩增，确定分离菌株的血清型;通过生长曲线测定、小鼠感染试验和药敏试验对分离菌株的生物学特性进行研究。结果表明，分离菌株为猪链球菌2型;分离菌株的生长情况与猪链球菌2型SC19菌株相似，但最高OD595值略低于SC19菌株;分离菌株对小鼠具有高致病性;分离菌株主要对青霉素类和头孢类药物敏感。这说明猪链球菌2型很可能是该猪场发病猪的病原，该猪场对猪链球菌感染的防控应优先选用青霉素类和头孢类药物。
　　关键词 猪链球菌;分离鉴定;血清型;致病性;药敏试验
　　中图分类号 S 852.61文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）01-0087-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.027
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Isolation， Identification and Biological Characterization of a Streptococcus suis Strain
　　ZHENG Cheng kun1， JIA Meng die1， WANG Yan hong2，3
　　（1. College of Biosciences and Biotechnology， Yangzhou University， Yangzhou，Jiangsu 225009; 2. College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou，Jiangsu225009; 3. Jiangsu Co innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou，Jiangsu225009）
　　Abstract To detect the pathogen of diseased pigs from a pig farm in Yangzhou， bacterial isolation and culture were conducted on the heart sample of a diseased pig. The bacterial species were determined by 16S rDNA sequencing and PCR amplification of gdh gene. The serotype of the isolated strain was determined by PCR amplification using the serotype specific primers. The biological characteristics of the isolated strain were explored by growth curve analysis， experimental infection of mice and antimicrobial susceptibility testing. The results showed that the isolated strain belonged to Streptococcus suis serotype 2. The isolated strain exhibited similar growth kinetics compared to S. suis 2 strain SC19， except that the maximum OD595 value was lower than that of strain SC19. The isolated strain also displayed high pathogenicity in a mouse infection model. Moreover， the isolated strain was sensitive to penicillins and cephalosporins. Collectively， the results suggested that S. suis 2 was likely to be the pathogen of the diseased pigs from the pig farm， and that penicillins and cephalosporins should be the preferred drugs for the prevention and control of S. suis infections.
　　Key words Streptococcus suis;Isolation and identification;Serotype;Pathogenicity;Drug susceptibility test
　　猪链球菌是一种革兰氏阳性致病菌，可以感染猪，导致脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎和关节炎，给养猪业带来重大经济损失[1]。此外，猪链球菌可以通過伤口和胃肠道途径感染人，引起脑膜炎和链球菌中毒性休克综合征等[2]。根据荚膜多糖抗原的差异，猪链球菌目前被分为29个血清型[3]。其中1、2、7和9型为发病猪中最流行的血清型[4]。尤其是2型被认为是全球范围内临床分离率最高、致病性最强的血清型[5]。在1998和2005年，我国2次暴发大规模人感染猪链球菌疫情，分别导致25人感染、14人死亡和215人感染、39人死亡[6]。截至2013年，全球范围内累计报道了超过1 600例人感染猪链球菌病例[1]。近年来，国内外仍然经常见到人感染猪链球菌的病例报道[7-10]，说明猪链球菌对公众健康和养猪业是一个持续的威胁。 　　最近扬州市某猪场发生一起疑似细菌感染事件，每天有3～5只猪（70日龄）死亡，持续5 d左右。笔者从该猪场送检的病猪心脏中分离出1株细菌;经16S rDNA测序和gdh基因扩增证实该菌为猪链球菌;经PCR鉴定，该猪链球菌为血清2型;小鼠感染试验结果显示，该菌具有较高的致病性;进一步对该菌进行了药敏试验，为猪场对猪链球菌感染的防控提供了参考依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 病料及试验动物
　　病料为扬州市某猪场送检的病猪心脏。雌性BALB/c小鼠（24只，SPF级，5周龄）购自南京市青龙山动物繁殖场。
　　1.2 主要试剂
　　16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit和PrimeSTAR Max Premix，购自宝生物工程（大连）有限公司;2×Taq Plus Master Mix Ⅱ和DL2000 Plus DNA Marker，购自南京诺唯赞生物科技有限公司;TSA（胰蛋白胨大豆琼脂）和TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）培养基，购自美国BD公司;新生牛血清为浙江天杭生物科技股份有限公司产品;药敏纸片为杭州微生物试剂有限公司产品。
　　1.3 细菌的分离纯化与保藏
　　将病料剪开，用接种环深入病料内部蘸取细菌，划线接种于添加10%新生牛血清的TSA平板，37 ℃恒温培养箱中培养约20 h。挑取单菌落划线接种于新的平板，进行纯化。再挑取单菌落，接种于添加10%新生牛血清的TSB培养基，37 ℃摇床中培养约5 h，用甘油保菌，冻存于-20 ℃条件下，用于后续试验。
　　1.4 细菌鉴定
　　参考16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit说明书，以纯化细菌的基因组DNA为模板，用试剂盒中的16S rDNA引物进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送交北京擎科新业生物技术有限公司测序。测序结果在NCBI网站上用Blastn进行比对，以确定细菌种属。同时，以纯化细菌的基因组DNA为模板，用猪链球菌gdh基因特异性引物（表1）进行PCR扩增，进一步确定细菌种属。
　　1.5 细菌血清型鉴定
　　参考文献[11]设计猪链球菌血清1型（含14型）、2型（含1/2型）、7型和9型的特异性引物（表1）。以纯化细菌的基因组DNA为模板，用4对分型引物分别进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送交北京擎科新业生物技术有限公司测序。测序结果用Clustal Omega进行多序列比对，以确定细菌血清型。
　　1.6 细菌生长曲线的绘制
　　挑取平板上的单菌落，接种于添加10%新生牛血清的TSB培养基，37 ℃摇床中培养约5 h。将该菌液1∶100转接于新鲜培养基，然后分装到96孔板中，每孔200 μL，设置5个重复。将96孔板置于37 ℃摇床中，每隔1 h取出，用酶标仪测定OD595值，绘制细菌的生长曲线。
　　1.7 小鼠感染试验
　　将细菌培养至稳定期前期，取菌液5 000 r/min离心去上清，菌体用PBS重悬，并将细菌浓度调整到1×109 CFU/mL。将BALB/c小鼠随机分为3组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每组8只。Ⅰ组小鼠腹腔感染2×108 CFU/只的分离菌株;Ⅱ组小鼠腹腔感染相同剂量的猪链球菌2型强毒株SC19[12];Ⅲ组小鼠腹腔注射200 μL PBS，作为对照。感染后观察7 d，每隔12 h记录1次小鼠症状及存活情况。
　　1.8 药敏试验
　　挑取平板上的单菌落，接种于添加10%新生牛血清的TSB培养基，37 ℃摇床中培养过夜。用PBS将菌液稀释到0.5麦氏浊度标准，然后用灭菌棉签将其均匀涂布于添加10%新生牛血清的TSA平板上。选取20种常用药物的药敏纸片，贴于涂布细菌的平板上，每块平板上贴4个药敏纸片。平板在37 ℃恒温培养箱中培养过夜，取出并测量抑菌圈直径。参考药敏纸片说明书判定药敏结果。
　　2 结果与分析
　　2.1 细菌的鉴定结果
　　分离的细菌在平板上形成圆形、光滑、有淡蓝色荧光的小菌落，与猪链球菌的菌落特征相一致。采用PCR扩增分离细菌的16S rDNA序列并测序，结果表明分离细菌为猪链球菌。用猪链球菌gdh基因特异性引物进行PCR鉴定，结果显示扩增出大小為653 bp的DNA片段（图1），进一步证实分离的细菌为猪链球菌。将分离菌株命名为YZ1802。
　　2.2 细菌的血清型
　　用表1中的分型引物分别进行PCR扩增，结果显示用cps2I-1/cps2I-2引物扩增出大小为314 bp的DNA片段，而用其他分型引物未扩增出DNA片段（图2），说明分离菌株YZ1802为血清2型或1/2型。参照文献[11]可知，cps2I基因（GenBank号为KC537364.1）的第981个碱基为T，而cps1/2I基因（GenBank号为KC537384.1）的第981个碱基为C。将扩增出的DNA片段测序后进行多序列比对，结果显示第981个碱基对应的位置为T（图3），因此分离菌株YZ1802为血清2型。
　　2.3 分离菌株的生长曲线
　　生长曲线显示，分离菌株YZ1802在接种后1 h进入指数期，5 h进入稳定期;YZ1802菌株的生长情况与猪链球菌2型SC19菌株相似，但最高OD595值略低于SC19菌株（图4）。
　　2.4 分离菌株的致病性
　　用小鼠感染模型评估分离菌株YZ1802的致病性。在感染后12 h，YZ1802组3只小鼠死亡，SC19组5只小鼠死亡;在感染后24 h，YZ1802组小鼠再死亡2只，SC19组小鼠再死亡3只。总体来看，YZ1802组小鼠死亡5只，SC19组小鼠全部死亡，对照组小鼠全部存活（图5）。尽管YZ1802组存活的小鼠数量多于SC19组，结果显示2组小鼠的存活率没有显著差异（P=0.089 8），说明YZ1802菌株同样具有高致病性。 　　2.5 分離菌株的药物敏感性
　　采用纸片扩散法测定分离菌株的药物敏感性，结果如表2所示，YZ1802菌株对13种药物敏感，对7种药物表现耐药或中介。YZ1802菌株表现敏感的药物主要是青霉素类（氨苄西林、羧苄西林、苯唑西林、青霉素、哌拉西林钠）和头孢类（头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢哌酮、头孢他啶、头孢曲松、头孢呋辛）。YZ1802菌株对氨基糖苷类中的庆大霉素表现敏感，而对该类别中的其他药物（丁胺卡那、卡那霉素、新霉素）表现耐药。此外，YZ1802菌株对大环内酯类（红霉素）和四环素类（四环素、多西环素、米诺环素）药物表现耐药或中介。
　　3 讨论与结论
　　猪链球菌是一种重要的人兽共患病原菌，其中2型是危害最严重的血清型[1]。该研究从扬州市某猪场送检的病猪心脏中分离出1株细菌，用16S rDNA测序和PCR扩增2种分子生物学方法证实该菌为猪链球菌。PCR法也经常被用于猪链球菌血清型的鉴定，但该方法无法区分1型和14型、2型和1/2型[11]。该研究创新地将PCR法和DNA测序技术相结合，利用2型和1/2型猪链球菌荚膜多糖合成相关基因上的一个碱基差异，证实分离的猪链球菌为2型。该研究也对1型和14型猪链球菌的区分具有借鉴意义。
　　小鼠感染模型被广泛用于猪链球菌毒力的评估[13]。因此，该研究以高致病性猪链球菌2型SC19菌株为参考菌株，用BALB/c小鼠评估分离菌株的毒力。虽然分离菌株感染组小鼠的死亡数量少于SC19菌株组，但2组小鼠的存活率没有显著差异，说明分离菌株同样具有高致病性。据此可推断猪链球菌2型感染很可能是该猪场猪发病的原因。
　　为了给猪场对猪链球菌病的防控提供参考，该研究检测了分离菌株的药物敏感性。结果显示，分离菌株主要对青霉素类和头孢类药物敏感，对氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类药物表现耐药或中介。该研究的药敏试验结果与Chen等[14]的研究结果类似。该猪场防控猪链球菌感染应优先选择青霉素类和头孢类药物。
　　该研究分离到一株猪链球菌2型菌株，该菌株具有高致病性，很可能是引起猪场猪发病的病原菌。药敏试验结果显示，分离菌株主要对青霉素类和头孢类药物敏感。该研究结果为猪场对猪链球菌感染的防控提供了参考依据。
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