人脂肪干细胞的生物学特性及分化研究

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　　摘要：目的  研究從人脂肪组织中获取人脂肪干细胞（hADSCs）的方法，并观察其形态特点、生物学特性、多谱系细胞分化的特点及间充质来源细胞表面相关标志的表达，探讨脂肪干细胞作为组织工程种子细胞的临床应用前景。方法  应用Ⅰ型胶原酶消化分离人脂肪组织，分时间段收集细胞并进行体外培养;采用流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD105等间充质来源细胞表面相关标志抗原的表达;利用成脂、成骨及成软骨诱导培养基对hADSCs进行定向分化诱导，观察细胞随诱导时间延长形态的变化，分别于诱导第11、14、21天进行油红O染色、茜素红染色及阿尔新蓝染色;采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖检测试剂盒检测hADSCs的增殖功能。结果  ①原代培养的hADSCs接种48 h后大部分细胞贴壁，为多角形的单层细胞;第3代细胞分裂增殖旺盛，细胞细长且排列规律;第8～9代后细胞形态不规则，胞内颗粒明显增多。②第3代hADSCs的表面抗原标记结果：CD29、CD44、CD105阳性表达，阳性率分别为98.89%、93.73%、86.99%;CD34、CD45阴性表达，阳性率分别为0.16%、0.11%。③hADSCs成脂诱导第11天、成骨诱导第14天、成软骨诱导第21天时细胞分化达到高峰，油红O染色、茜素红染色、阿尔新蓝染色均为阳性;④第4、5、6代（P4、P5、P6）hADSCs随培养时间的延长，均呈增长趋势，细胞平均从第24 h开始进入指数增长期，三代之间细胞增殖功能比较： P4>P5，P6>P5，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  本次成功从人脂肪组织中分离、培养出目的细胞，经初步鉴定，证实其为hADSCs，同时成功对hADSCs进行了成脂、成骨及成软骨定向诱导分化。hADSCs的增殖能力可能会随传代次数的增加而有所下降;无血清刺激也可能会影响hADSCs的增殖功能，使其增殖能力有所下降。
　　关键词：脂肪干细胞;定向诱导分化;细胞增殖
　　中图分类号：R329                                  文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.027
　　文章编号：1006-1959（2020）01-0089-05
　　Study on Biological Characteristics and Differentiation of Human Fat Stem Cells
　　LI Ying，LI Xiao-bing
　　（Plastic and Burn Surgery，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300000，China）
　　Abstract：Objective  To study the method of obtaining human adipose stem cells （hADSCs） from human adipose tissue， and to observe its morphological characteristics， biological characteristics， characteristics of multi-lineage cell differentiation， and expression of relevant markers on the surface of mesenchymal-derived cells， and to explore adipose stem cells. Prospects for clinical application of tissue engineering seed cells. Methods  Human adipose tissue was isolated and digested with type I collagenase， and cells were collected in time and cultured in vitro. Flow cytometry was used to detect the expression of surface-associated marker antigens on cells such as CD29， CD34， CD44， CD45， and CD105; Adipogenic， osteogenic， and chondrogenic induction media induce directional differentiation of hADSCs. Observe the morphological changes of cells with prolonged induction time. Oil red 0 staining， alizarin red staining， and Al New blue staining; Cell Counting Kit-8 （CCK-8） cell proliferation detection kit was used to detect the proliferation function of hADSCs.Results  ① 48 h after inoculation of primary cultured hADSCs， most of the cells were adherent， and they were polygonal monolayer cells; the third-generation cells had vigorous division and proliferation， and the cells were slender and arranged regularly. After the 8th to 9th generations， the cell morphology was irregular and the intracellular particles increased significantly. ② Surface antigen labeling results of the third generation hADSCs： CD29， CD44， and CD105 were positively expressed， with positive rates of 98.89%， 93.73%， and 86.99%， respectively; CD34 and CD45 were negatively expressed， with positive rates of 0.16% and 0.11%， respectively. ③ hADSCs reached the peak of cell differentiation on the 11th day of adipogenic induction， the 14th day of osteogenesis induction， and the 21st day of chondrogenic induction， and oil red O staining， alizarin red staining， and alcin blue staining were all positive; ④The 4th， 5th， and 6 th generation （P4， P5， P6） hADSCs showed an increasing trend with the increase of culture time. The cells entered an exponential growth period from the 24 h on average. Comparison of cell proliferation functions between the three generations： P4> P5， P6> P5， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  The target cells were successfully isolated and cultured from human adipose tissue this time. After preliminary identification， they were confirmed to be hADSCs. At the same time， hADSCs were successfully induced into adipogenic， osteogenic and chondrogenic differentiation. The proliferative capacity of hADSCs may decrease with the increase of the number of passages; serum-free stimulation may affect the proliferative function of hADSCs and reduce their proliferative capacity. 　　Key words：Adipose stem cells;Directional induced differentiation;Cell proliferation
　　脂肪间充质干细胞（ADSCs）是一种来源于中胚层的细胞。目前研究表明，ADSCs具有和骨髓来源的间充质干细胞相似的生物学性状和免疫表型，并且已经证实其在体外具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、心肌细胞等分化的能力，且其诱导分化的体系和骨髓来源的间充质干细胞相似[1]。脂肪组织来源的间充质干细胞除了具有间充质干细胞的共性外，还具有以下特点[2]：脂肪组织来源广泛、取材容易，如患者进行局部麻醉后吸脂术即可获得。不同组织来源的间充质干细胞免疫活性不同可能与间充质干细胞处于不同组织中的活化状态、种属差异、组织来源和培养条件的不同有关[3]。脂肪来源的间充质干细胞不易受到肿瘤细胞的污染，更容易进行体外净化，具有免疫抑制作用。因此，从脂肪组织中获得种子细胞，成为组织工程种子细胞的理想来源。人类脂肪组织可通过切取或吸脂术获得，由于吸脂术的微创性及美体作用，该方法可成为医生及患者更容易接受的细胞获取方式。本研究拟从人脂肪组织中获取人脂肪干细胞（hADSCs），观察其形态特点、生物学特性，并对其进行诱导分化，探讨其应用前景。
　　1材料与方法
　　1.1材料来源  成人脂肪组织来源于整形外科健康缩乳手术患者，均为女性，年龄19～40岁，无糖尿病、肝炎、代谢性疾病及其他系统性疾病，在知情同意的情况下，取术中废弃脂肪组织。
　　1.2方法
　　1.2.1人脂肪干细胞的分离、体外培养  将无菌条件下获取的脂肪组织用PBS清洗，切成0.5 mm×0.5 mm无残余血液、皮肤和纤维组织的碎片，37℃下在1 mg/ml胶原酶Ⅰ（Gibco，USA）中消化1～2 h。于1000 r/min离心5 min，去除上清液。将细胞悬浮在含有10%FBS（Hyclone，USA）的DMEM（Gibco，USA）中，37℃、5%CO2温箱中培养。48 h后观察粘附细胞。培养基每3 d更换1次。当细胞达到80%汇合时进行传代，第3代细胞用于随后的实验。
　　1.2.2人脂肪干细胞表面抗原鉴定  第3代细胞用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA（sigma，USA）消化，悬浮于含0.1%BSA（sigma，USA）的PBS中，細胞密度为3.0×106/ml。将100 μl细胞悬液添加到2 mlEP管中，再将标记抗体稀释液（表1）加入到样品管中。样品在4℃下避光孵育30 min。孵育后，在每个样品管中加入1.5～2 ml PBS和0.1%BSA。离心（244 g，    4 min），将细胞悬浮于含0.1%BSA的PBS 400 μl溶液中进行后续检测。
　　1.2.3人脂肪干细胞定向诱导分化  ①成脂分化诱导：37℃的6孔培养板中加入第3代细胞，5%CO2培养基培养，直到细胞达到100%融合。将原培养基替换为2 ml完全成脂培养基A（cyagen，USA）培养3 d，然后将其替换为完全成脂培养基B（cyagen，USA）培养24 h。介质A和B交换重复3个周期。用10%中性福尔马林固定30 min，1 ml油红O工作液（Sigma，USA）染色10 min，显微镜下观察细胞。②成骨分化诱导：第3代细胞在上述培养基中培养直到细胞融合80%～90%，替换为2 ml完全成骨分化培养基（Cyagen，USA），每3 d更换1次培养基。3周后用10%中性福尔马林固定30 min，1 ml茜素红（sigma，USA）染色5 min，显微镜下观察细胞。③成软骨分化诱导：第3代细胞接种于离心管中，培养基为完全软骨分化培养基（cyagen，USA），平均每管细胞数为2×105/ml。每2～3 d更换1次培养基。在诱导培养基中培养3～4周后，固定细胞进行石蜡切片，阿尔新蓝50～60℃染色15 min，显微镜下观察细胞。
　　1.2.4 CCK-8检测细胞增殖  分别取第4代（P4，无血清的DMEM培养基饥饿12 h）、第5代（P5，无血清的DMEM培养基饥饿12 h）、第6代（P6，未饥饿）脂肪干细胞，胰酶消化后计数，调整细胞密度为1×105/ml。96孔板中每孔2000个细胞，每组设8个平行复孔，共6个时间点。计算所需细胞总数和液体总量，铺板。分别于12、24、36、48、60、72 h后取出96孔板加入CCK-8溶液，每孔10 μl，检测各孔的吸光度值;在酶标仪上选择450 nm波长，检测各孔的吸光度值D450。以时间为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线，将只含加培养基不加细胞作为空白对照孔调零。
　　1.3统计学分析  采用SPSS 16.0软件处理数据，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组数据经检验均为方差齐;当各组比较有统计学意义时，任意两组比较用LSD-t法，以P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1人脂肪干细胞的形态观察  细胞接种48 h后可见大部分细胞开始贴壁，为多角形的单层细胞。有的细胞体细长，似成纤维细胞（图1-A1）。72 h后大多数细胞贴壁，并开始伸展、分裂，呈梭形（图1-A2）。5～7 d后细胞逐渐分裂、融合成单层并铺满瓶底     （图1-A3）。传代后细胞呈梭形，核居中，多数为1个核仁，也可双核仁，呈圆形或卵圆形，细胞成簇分布，排列有一定的极性（图1-B1）。细胞平均传代扩增时间约为3 d，第3代细胞分裂增殖旺盛，细胞细长，排列紧凑且规律（图1-B2）。第8～9代以后，细胞形态不规则，缺乏立体性，细胞边缘融合不清，胞内颗粒明显增多，培养液中可见较多的细胞碎片（图1-B3）。 　　2.2人脂肪干细胞的表面抗原鉴定结果  第3代人脂肪干细胞的表面抗原标记结果：CD29、CD44、CD105阳性表达，阳性率分别为98.89%、93.73%、86.99%;CD34、CD45阴性表达，阳性率分别为0.16%、0.11%，见图2。
　　2.3人脂肪干细胞的定向诱导分化结果
　　2.3.1成脂诱导分化  成脂诱导72 h后，镜下观察可见细胞立体感增强，细胞内有小脂滴出现（图3-A1），约1周后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形（图3-A2），诱导第11天时，细胞分化达到高峰，可见大量脂滴融合成团（图3-A3），油红O染色阳性，显示有大量脂质沉淀（图3-A4）。
　　2.3.2成骨诱导分化  诱导第4天细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多;第8天胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间见钙质沉积（图3-B1，箭头）;第12天细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显（图3-B2，箭头）;第14天诱导分化达到高峰，可见大量钙沉积，并融合成片（图3-B3，箭头），茜素红染色阳性，呈红色结节（图3-B4，箭头）。
　　2.3.3成软骨诱导分化  诱导24 h后，细胞成小颗粒状漂浮在诱导液中，单个细胞形态无明显变化。随诱导时间延长，在细胞密度较大处细胞群逐渐聚集;诱导第7天即可在聚集细胞的表面看到微黄色的物质积累，量逐渐增多;诱导第21天达到高峰，阿尔新蓝染色阳性（图3-C1、C2）。
　　2.4 hADSCs的增殖功能  第4代细胞随培养时间的延长，均呈现增长趋势。从第24 h开始进入指数增长期，各时间点与前一时间点细胞平均吸光度值比较，差异有统计学意义（F=13.230，P<0.05）;其中细胞平均吸光度值在36 h比24 h增加了28.00%，60 h比48 h增加了21.88%。第5代细胞从第48 h开始进入指数增长期，各时间点与前一时间点细胞平均吸光度值比较，差异有统计学意义（F=56.525，P<0.05），细胞平均吸光度值在60 h时比48 h增加了38.46%，72 h比60 h增加了72.22%。第6代细胞从第24 h开始进入指数增长期，各时间点与前一时间点细胞平均吸光度值比较，差异有统计学意义（F=23.890，P<0.05），其中细胞平均吸光度值36 h比24 h增加了71.43%。见图4A。
　　不同代数之间細胞增殖功能比较，细胞平均吸光度值的趋势为：P4>P5，P6>P5，三代之间两两比较，各时间点差异均有统计学意义（F=40.855、13.976、58.260、52.616、38.616、11.573，P均<0.05）。见图4B。
　　3讨论
　　软骨、心肌、神经等组织由于缺乏再生能力，其损伤修复一直是医学领域的难题。以干细胞为基础的组织工程技术为解决这一难题提供了可能，其核心是建立由种子细胞和支架构成的三维空间复合体。其中，种子细胞的选择非常重要，与胚胎干细胞相比，成体干细胞由于无伦理争议，更适合作为组织工程的种子细胞。目前，在成体干细胞中，间充质干细胞（MSC）的研究开展较早，并已作为种子细胞进行了组织工程方面的相关研究。但取骨髓时患者比较痛苦，而且可获得的MSC数量甚少，要以体外扩增来得到足够的细胞数，所需周期长且造价昂贵。随着MSC研究的不断深入，人们对MSC的生物学特性、分化能力及临床应用有了进一步认识[4]。研究发现，脂肪组织位于较易获得的结缔组织内，和骨髓一样来源于间充质，其中存在的一类干细胞族的克隆细胞株称为脂肪干细胞（ADSCs）。这些细胞可以从脂肪组织中大量分离，和MSCs一样具有多向分化潜能，在一定条件下可以向脂肪、骨、软骨、心肌细胞、神经细胞等分化。而相比MSCs，ADSCs具有的优点是：取标本时患者痛苦小;细胞含量丰富，每单位体积脂肪组织中含有多分化潜能细胞的数量约是骨髓组织的500倍以上;不需进行长期的体外扩增。因此，ADSCs体外扩增能力强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞[5]，其可能更适合作为组织工程的种子细胞。
　　本实验发现，100 ml脂肪组织可产生约2×107个细胞，在传代培养中，平均倍增时间约为2～3 d，并能保持稳定的倍增率至第8代。这表明ADSCs的增殖能力很强，传代培养时易于获得大量有分化能力的细胞。ADSCs与成纤维细胞形态相似，且都无特异性的鉴别标志。有研究将脂肪组织和结缔组织用胶原酶消化后，比较两者获得的细胞发现：脂肪来源的细胞内脂肪聚成大滴，成纤维细胞只有少量的脂滴，且30%～40%的原代ADSCs能自发生成脂肪细胞，提示原代分离的细胞来源于脂肪基质。随着培养时间的延长和换液次数的增加，这些细胞基本可被清除，说明应用以上原代细胞培养法可从人脂肪组织中分离出hADSCs，并可进行体外培养扩增。
　　目前，ADSCs尚缺乏特异性的表面标记物，常用的鉴定方法有免疫组化染色和流式细胞仪检测表面抗原等，但采用单一检测方法来鉴定ADSCs是不全面的。因此，本实验通过流式细胞仪进行细胞表面抗原标记物的检测和成脂、成骨、成软骨定向诱导等实验对ADSCs进行初步鉴定。ADSCs表面标志蛋白主要有CD9、CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、 CD105、CD106、CD146、CD166、HLA-ABC，诱导分化培养后ADSCs虽表现出成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞等已分化细胞的特征，但表面蛋白的表达却与未分化前基本一致。这些表面蛋白与MSCs的表面蛋白很相似，CD29、CD44、CD71、CD70、CD105等为阳性标记，CD31、CD34、CD45等为阴性标记。CD45在内皮细胞、成纤维细胞中有表达，而ADSCs不表达。本实验第3代hADSCs的表面抗原标记结果为CD29、CD44、CD105阳性表达，阳性率分别为98.89%、93.73%、86.99%;CD34、CD45阴性表达，阳性率分别为0.16%、0.11%。 　　ADSCs与MSCs类似，在不同的培养条件下可分化为不同的中胚层来源的组织细胞。本实验中分别加入成脂、成骨及成软骨诱导培养基，诱导培养一定时间后进行特异染色，結果均为阳性，证实其具有多向分化潜能。本实验将细胞置于离心管内进行立体培养，相比单层平面培养更利于其向软骨定向分化。不同代数之间细胞增殖功能比较显示：细胞平均吸光度值的趋势为：P4>P5，P6>P5。分析原因：P4、P5和P6细胞培养的血清条件不同，P4、P5均在测增殖功能前用无血清的培养基饥饿12 h，而P6细胞无低血清饥饿刺激，说明同一血清条件下，随着代数的增加hADSCs增殖能力有所下降;不同血清条件下，无血清刺激可以影响hADSCs的增殖功能，其增殖能力有所下降。
　　研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病，干细胞具有的多向分化潜能和自我更新能力使其成为未来再生医学的重要种子细胞，并成为研究人类早期胚层特化和器官形成、药物筛选以及基因治疗的最佳工具。利用胚胎干细胞治疗疾病有着广泛的应用前景，但它的应用还受到社会伦理方面的制约。而成体干细胞横向分化的发现对于细胞研究和应用具有重要意义，从患者体中分离出成体干细胞，在体外定向诱导分化为特定组织细胞，将这些细胞自体移植回输该患者体内，从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官，然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入，来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景，还将对克隆动物、转基因动物生产、发育生物学、新药物的开发与药效和毒性评估等领域产生极其重要的影响。
　　综上所述，本研究成功分离培养出hADSCs，对hADSCs进行了成脂、成骨、成软骨的定向诱导分化;并研究了细胞的增殖功能，初步探讨了脂肪来源干细胞作为构建组织工程种子细胞的可行性，同时对干细胞作为组织工程种子细胞临床应用前景进行了展望。
　　参考文献：
　　[1]Chun SY，Lim J，Lee EH，et al.Preparation and Characterization of Human Adipose Tissue-Derived Extracellular Matrix，Growth Factors，and Stem Cells：A Concise Review[J].Tissue Eng Regen Med，2019，16（4）：385-393.
　　[2]农霖.脂肪干细胞的生物学特性、分化潜能及应用[J].中国医疗美容，2015（4）：99-101.
　　[3]方洪松，周建林，彭昊，等.不同来源间充质干细胞生物学特性差异[J].中国组织工程研究，2015，19（32）：5243-5248.
　　[4]弓勋，云升.间充质干细胞的生物学特性及应用[J].中国医学工程，2018，26（12）：44-48.
　　[5]胡晓根，张文健，王在，等.体外培养人脂肪干细胞生物学特性的初步探究[J].中日友好医院学报，2015，29（5）：287-289，封2.
　　收稿日期：2019-10-15;修回日期：2019-11-05
　　编辑/成森
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