一株产酸黑曲霉的分离鉴定及其在盐碱土改良中的应用

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　　摘要：本研究从青岛海边盐土土样中筛选得到试验菌株，对其进行形态学、分子生物学、产酸及耐盐能力鉴定，同时将其配制成菌剂加入不同基质中施入盐碱土壤以探究其在盐碱地改良中的应用潜力。结果显示：形态学与分子生物学方法鉴定得到该菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）;它能够分泌有机酸，能在80 h内将发酵液pH值由6.58降至1.96;并且在10% NaCl或10% （NH4）2SO4的液体培养基中保持较好的生长曲线，拥有较好耐盐能力。以不同基质作为生长介质将菌剂直接施加到盐碱土壤56 d后，检测到添加不同基质的盐碱土壤pH值可降低0.86～1.60，含盐量也下降。因此黑曲霉在盐碱地改良中具有较好的应用潜力。
　　关键词：黑曲霉;盐碱地;鉴定;改良
　　中图分类号：S154.2：S156.4+2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）04-0069-06
　　Abstract In this study， the experimental strain was screened out from the coastal saline soil samples in Qingdao， and was identified through the morphology， molecular biology， acid production and salt tolerance，so as to explore the application potential in the improvement of saline-alkali land. Through the morphological and molecular biological methods，the strain was identified   as Aspergillus niger. This strain could secrete organic acid and reduce the pH value of the fermentation broth from 6.58 to 1.96 within 80 hours. At the same time， the strain maintained a good growth curve and had a good salt tolerance in the liquid medium with 10% NaCl or 10% （NH4）2SO4. The microbial inoculum was directly applied to the saline-alkali soil with different substrates as growth media， after 56 days， it was detected that the pH values of the saline-alkali soils added with different substrates reduced by 0.86 ～ 1.60， and the salt contents also decreased. Therefore， Aspergillus niger had a good application potential in the improvement of saline-alkali land.
　　Keywords Aspergillus niger; Saline-alkali soil; Identification; Improvement
　　鹽碱地是盐类集积的一类土地，其土壤中所含的盐分可对作物的正常生长产生影响，在盐碱程度严重地区植物几乎不能生存。中国是世界排名第三的盐碱地大国[1]，未开发和影响耕种的盐碱地总面积大于0.33×108 hm2，分布于东北、西北、华北及滨海等地区在内的17个省区，改良盐碱地已成为改善我国环境和解决我国粮食安全问题的重要手段。目前对盐碱地的改良方法可分为物理、化学和生物改良法[2]。物理、化学方法存在成本高、工程大、改良后土壤等级差并且容易返盐等问题;而生物方法研究较少，且大多为植物改良，也存在周期长等问题[3]。因此，寻求成本低廉、效果持久、周期较短的新改良方法一直是科学家们关注的热点。
　　微生物改良盐碱地的方法具有高效、经济、环保、安全和适用范围广等优点，还可防止土壤恶化，所以在改良低肥力的盐碱地上表现出重大的应用潜力[4]。目前用于盐碱地改良的生物功能菌有硫氧化细菌[5]、磷细菌[6]、钾细菌[7]、菌根菌[8]和光合细菌[9]，它们可以使盐碱土pH值下降0.25～1.00[5-11]。霉菌属于真菌的一个类别，能分泌生物酸，如草酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸和葡萄糖酸等多种有机酸[12，13]，现已广泛应用于食品等多个领域中。但目前鲜有用霉菌直接降盐或降pH值来改良盐碱土壤的研究报道。本研究从青岛海边盐土中分离一株霉菌，并对其进行纯化和形态、分子生物学鉴定，对其产酸能力及耐盐能力进行分析，以期探究霉菌在盐碱土壤改良中的应用潜力。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　供试土壤样品（用于菌株筛选）取自青岛海边盐土（约N37°03′，E119°40′）。供试对照菌株为放线菌（WH17050900907），本实验室自盐碱地筛选。
　　供试培养基：刚果红培养基（NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KNO3 01 g，FeSO4·7H2O 001 g，可溶性淀粉20 g，琼脂15 g，刚果红02 g，去离子水定容至1 000 mL，调整pH值在70～74之间，121℃灭菌20 min）;察氏琼脂培养基（NaNO3 2 g，K2HPO4·3H2O 1 g，MgSO4·7H2O 05 g，KCl 05 g，FeSO4·7H2O 001 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，去离子水定容至1 000 mL，调整pH 值在70～74范围内，121℃灭菌20 min）;发酵培养基（葡萄糖50 g，酵母粉5 g，KH2PO4·H2O 14 g，MgSO4·7H2O 05 g，（NH4）2SO4 10 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，ZnSO4 0.03 g，去离子水定容至1 000 mL，调整pH值为 6.8，112℃灭菌30 min）。 　　供试有机质材料为麦麸、豆渣、干草、树叶、玉米粉、甘蔗渣、橘皮。盐碱土（用于菌株耐盐鉴定）取自河南省兰考县城关乡余寨村盐碱地（约N34°46′，E114°48′），初始pH值为9.80，含盐量约为10 g/kg。自制复合肥（蔗糖∶NaNO3=3∶1）。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 菌株筛选、纯化及形态学鉴定 称取1 g土壤样品溶于9 mL无菌水，稀释103、104、105倍后分别涂于刚果红培养基上，30℃培养，将产生较大蓝紫色透明圈的菌落挑出，反复划线分离获得纯种菌株，斜面保藏于试管中。取菌株接种于察氏培养基于30℃培养5 d，运用直接制片观察法制片镜检进行形态学鉴定。
　　1.2.2 菌株分子生物学鉴定 将纯化后的菌株接种于发酵培养基中，30℃、200 r/min培养24 h，采用CTAB法提取基因组DNA，扩增目标菌株的ITS rDNA序列，将PCR产物进行测序。序列测定结果用BLAST，选择GenBank数据库进行同源性比对，比对后从GenBank中选择和下载近缘菌株的ITS rDNA序列，用Mega X构建系统发育树。
　　1.2.3 菌株的产酸能力鉴定 准备33个150 mL锥形瓶，每瓶装入60 mL发酵培养基，112℃灭菌30 min，冷却至室温。接种环挑取一环菌株溶解于5 mL无菌水中，摇匀后取0.2 mL接种于灭菌的发酵液中，30℃、200 r/min振荡培养，每隔8 h取出3瓶测菌液pH值。
　　1.2.4 菌株的耐盐能力鉴定 将试验培养基按照表1进行配制。7种培养基分别混合均匀后，均于121℃灭菌20 min。挑取黄豆粒大小的菌株于100 mL无菌水中，混合均匀。分别于各平板中接入5 mL菌液，混合均匀，30℃培养，每隔4 h观察并记录菌株生长情况，并将观察时未生长的培养基转接于刚果红固体培养基检测菌株存活情况。
　　1.2.7 菌株在有机质中的生长探究 分别称取一定量有机介质：碎干草（校园，禾本科）、碎树叶（校园，泡桐）、麦麸、豆渣、碎橘皮、甘蔗渣、玉米粉、麦麸豆渣混合物、碎干草树叶混合物于培养皿中，灭菌备用。接种环挑取黄豆大小黑曲霉于500 mL无菌水中充分混匀。将菌液接种于灭菌有机质培养基中，30℃培养5 d，每隔12 h观察并记录每种有机质上菌种生长状态。
　　1.3 数据处理
　　利用Microsoft Excel 2016进行数据整理及作图。
　　2 结果与分析
　　2.1 菌株形态学鉴定
　　形态学特征：菌丛大而疏松，正面呈黑褐色，背面白色至黄色，顶囊和分生孢子均为球形，顶囊放射状排满小梗，分生孢子呈黑褐色，具有霉味（图1）。根据形态初步判定其为一株黑曲霉[14]。
　　[HT6SS]A.培养基正面;B.培养基背面;C.显微镜下菌种形态;D.显微镜下孢子囊形态
　　[JZ]图1 菌株AN1014形态学鉴定
　　2.2 菌株分子生物学鉴定
　　由图2可知，黑曲霉Aspergillus niger strain 01NT.1.5.4与试验菌株（AN1014）同源性最高，结合形态学特征，确定菌株AN1014为黑曲霉。
　　2.3 黑曲霉产酸能力
　　黑曲霉接种于发酵培养基中培养80 h后，培养基对应pH值由6.58降至1.96。0～8 h黑曲霉处于延滞期，菌株处于适应与储备阶段，试验过程中未明显观察到菌株生长;8～24 h菌株代谢旺盛，产生大量有机酸，发酵液pH值下降较快，在此阶段观察到菌株聚集成菌丝球，菌体繁殖迅速;32～64 h菌株生长代谢减缓，pH值下降隨之减缓;64 h之后，发酵液中的菌体近乎停止生长，72 h后菌丝球伴有降解现象（图3）。试验证明，该菌株具有良好的产酸能力，在生长代谢过程中能产生大量有机酸。
　　2.4 黑曲霉耐盐能力分析
　　[HT5K]2.4.1 黑曲霉耐盐能力 [HT] A、D、F、E、B、G处理培养基在60 h内分别先后生长出明显的肉眼可见的菌丝体，但C处理（3.50 g麦麸豆渣有机质培养基添加1.05 g NaCl），由于过高的NaCl浓度，菌体始终未生长（表4）。将此处理试验平板上的有机质转接到刚果红培养基上，刚果红培养基上长出菌落，产生紫色透明圈，生长时间与普通转接试验的无异，证明1.05 g NaCl浓度抑制菌体生长但未影响其生长潜力。
　　2.4.2 黑曲霉与放线菌对盐耐受力比较 前60 h，10%NaCl组中黑曲霉的生长率一直都高于放线菌，10%（NH4）2SO4组中黑曲霉的生长率在培养66 h内也一直都高于放线菌（图4），30 h之后10%（NH4）2SO4发酵培养基中黑曲霉的生长情况甚至优于普通发酵培养基。综合比较，在10%NaCl和10%（NH4）2SO4的发酵培养基中，黑曲霉较放线菌表现出更好的适应能力。生长率计算公式：
　　生长率=10%NaCl或（NH4）2SO4的发酵培养基中的菌株干重/普通发酵培养基中的菌株干重。
　　2.5 黑曲霉对盐碱土的作用
　　由图5可以看出，与CK相比，不施加菌剂的土壤均可明显看出相应检测指标数值的降低。效果较为明显的为添加5.0 g NaNO3+5.0 g菌剂土壤的pH值，相对于CK下降1.60，相对于添加5.0 g NaNO3但不施加菌剂的处理下降1.24。添加5.0 g豆渣施+5.0 g菌剂的土壤pH值相对于CK下降1.37，相对于添加5.0 g豆渣但不施加菌剂的土壤下降1.22。复合肥的效果略差，但也有明显下降。本试验中，在56 d内，添加菌剂的土壤中含盐量和pH值均有明显下降，可见试验黑曲霉对降盐和降pH值均有一定效果。
　　2.6 黑曲霉自然有机生长介质探究
　　由表5可知，黑曲霉在麦麸、豆渣、碎干草等日常废弃有机质材料中可以较好生长，在部分混合材料中生长良好。 　　3 讨论与结论
　　本研究表明，试验黑曲霉拥有良好的耐盐能力，能够在高盐环境中生长，这是将黑曲霉运用于盐碱地改良的必要前提。试验黑曲霉具有良好的产酸能力，在NaNO3存在条件下，能够在较短时间内使盐碱土的pH值下降1.60，显著优于其它微生物，在已有的研究中鲜少见到此类可以在较短时间内较大幅度降pH值的报道;同时，在运用黑曲霉改良盐碱土的试验中，土壤含盐量也明显下降。相较于已有的盐碱地改良案例，将黑曲霉运用于盐碱地改良具有周期短、效力强的优越性。另外，本研究显示，黑曲霉可以在廉价易得甚至日常废弃的有机质材料中较好生长。此类材料不论是在经济上还是获取途径上，相较于一般肥料或者基质都表现出极大的优越性。另外，将其施入土壤中也可代替日常肥料为土壤提供养料。此结果使本研究探索的将黑曲霉用于盐碱地改良表现出了实施可行性与经济可行性。
　　本研究将霉菌应用于盐碱地的改良并获得显著的效果，为微生物修复盐碱土提供了较新的研究思路，在解决盐碱地问题上具有良好的应用潜力。目前仍有以下问题值得探索：（1）黑曲霉在盐碱土中的生长规律和泌酸持续时间，从而探究适合黑曲霉的最佳生长条件，使黑曲霉能够高效分泌有机酸，降低盐碱土的pH值;（2）霉菌的降盐机理以及最优降盐条件，进而研究使霉菌高效降盐的方法，以期在盐碱地改良中达到优良降盐效果;（3）普遍认为，在盐碱地改良中混合菌剂优于单菌种，因此寻求多种能与黑曲霉相互协同的特定微生物是必要的;（4）筛选对作物无害的菌株或者在盐碱地改良完成后引入其它措施将菌株杀灭，避免菌株对作物生长产生负面影响。
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