一株对羟基苯甲酸甲酯降解菌的生长及降解特性研究

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　　摘 要：以具有内分泌干扰性的对羟基苯甲酸甲酯（MeP）为目标污染物，研究细菌1a51的生长曲线以及对水中MeP的降解。结果表明，菌株在R2A液体培养基中培养16小时后进入对数生长期，60小时后进入稳定期，随后进入凋亡期;菌株的最适降解pH为7，最适降解温度为35℃，随着目标污染物MeP浓度的提高，一定时间内的降解率逐渐降低后达到稳定，不同的金属离子对降解影响不同，Cd2+对菌株降解MeP的抑制效果最明显，Zn2+對降解几乎没影响，本研究结果可为防腐剂的微生物降解提供一定的依据。
　　关键词：内分泌干扰性;对羟基苯甲酸甲酯;细菌;生长曲线;降解
　　Abstract：The growth curve of bacteria 1a51 and the degradation of methylparaben（MeP）which possessed endocrine disruption in water were studied.The results showed that the strain entered the logarithmic growth stage and stable stage after being cultured in R2A liquid medium for 16 h and 60 h，then entered the phase of apoptosis.The optimal pH and temperature of MeP being degraded by strain 1a51 were 7 and 35℃，respectively.With the concentration of MeP increasing，the degradation rate of MeP decreased and then achieved stable.The influence of different metal ions on the degradation of MeP was different.Cd2+had a significant inhibition effect while Zn2+had little effect.The research results could provide basis for the microbial degradation of preservatives.
　　Key words：Endocrine disruption;Methylparaben;Bacteria;Growth curve;Degradation
　　1 绪论
　　对羟基苯甲酸酯类（Parbens）是一类常见的防腐剂，被广泛用于食品、药品以及个人护理品行业[1，2]。Parbens是由对羟基苯甲酸和脂肪醇脱水缩合形成的一类酯类有机化合物，多为无色的结晶，具有良好的水溶性和一定范围pH内较高的稳定性[3]，其中对羟基苯甲酸甲酯（MeP）是使用最广泛的一种。
　　近年来，Parabens在人们的生活中使用日益广泛，但是由于其在环境中的迁移最终对人类和其他生物造成的干扰危害而被美国环保署列为内分泌干扰物[4]。有报道称在人的乳腺肿瘤中发现有Paraens的存在，因此推测乳腺癌与皮肤使用含Paraens的产品之间可能存在潜在的联系。
　　目前对环境中Parabens的去除主要是在污水处理厂中，更多的是集中在物理化学方法上，比如：吸附、膜分离、高级氧化法等，虽然都各有优点但是都存在着投资大，能耗高，操作困难，易产生二次污染等缺点。随着生物技术的发展，微生物也被广泛用来去除水体中存在的Parabens。有报道发现MeP在好氧条件下易于生物降解，生物需氧量约为理论需氧量的90%[5]。目前也有关于对Parabens的降解菌株的报道，苗艳芳等从其汽酒厂废水分离得到一株可以高效降解对羟基苯甲酸的菌株BJS3，在24h内的降解率达到99.93%[6];张丽平等人从海底底泥中分离得到一株可将MeP降解为对羟基苯甲酸的棒状菌株[2]。
　　本研究对从活性污泥中分离得到的MeP降解菌菌株的生长曲线和影响MeP降解的因素进行了探究，以期对环境中防腐剂的微生物降解提供依据。
　　2 实验材料与方法
　　2.1 主要试剂与仪器
　　2.1.1 主要试剂
　　对羟基苯甲酸甲酯（MeP，纯度>99%）购自上海麦克林试剂公司;氢氧化钠（NaOH，分析纯）、盐酸（HCl，分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司;硝酸锰（Mn（NO3）2，50%）购自天津市光复科技有限公司，六水合硝酸锌（Zn（NO3）2·6H2O，分析纯）购自上海麦克林生化科技有限公司，硝酸铜（Cu（NO3）2，分析纯）购自天津福晨化学试剂厂，硝酸镍（Ni（NO3）2，分析纯）购自广东光华科技股份有限公司，六水合硝酸钴（Co（NO3）2·6H2O，分析纯）购自上海麦克林试剂有限公司，四水合硝酸钴（Cd（NO3）2·4H2O，分析纯）购自西陇科学股份有限公司。
　　2.1.2 主要仪器
　　恒温气浴振荡器（THZ-82A，金坛市晶玻实验仪器厂），超净工作台（HCB-1300V，青岛海尔生物医疗股份有限公司），立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-100G，上海博讯实验有限公司医疗设备厂），高效液相色谱（1260Infinity II，美国安捷伦科技有限公司），精密电子天平（Scout SE-SE202F，奥豪斯仪器（常州）有限公司），数控超声波清洗器（KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司），超纯水机（UPT-Ⅱ-10T，四川优普设备仪器有限公司），pH计（PHS-25，雷磁仪电科学仪器有限公司），紫外可见分光光度计（TU-1901，北京谱析通用仪器有限责任公司），生化培养箱（SPX-150B-Z，上海博讯实验有限公司医疗设备厂）。 　　2.2 培养基及使用
　　2.2.1 R2A液体培养基及使用
　　培养基组分：胰蛋白胨0.25mg/L，酸水解酪蛋白0.5mg/L，酵母浸粉0.5mg/L，可溶性淀粉0.5mg/L，磷酸氢二钾0.3mg/L，硫酸镁0.1mg/L，丙酮酸钠0.3mg/L，蛋白胨0.25mg/L，葡萄糖0.5mg/L。
　　使用：取本品3.2g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15分钟;冷却后备用。
　　2.2.2 R2A固体培养基及使用
　　培养基组分：酵母浸出粉0.5mg/L，可溶性淀粉0.5mg/L，蛋白胨0.5mg/L，磷酸氢二甲0.3mg/L，酪蛋白水解物0.5mg/L，丙酮酸钠0.3mg/L，葡萄糖0.5mg/L，无水硫酸镁0.024mg/L，琼脂15.0mg/L。
　　使用：取本品18.2g，加入1L纯化水，加热溶解，121℃高压灭菌15分钟，待温度降至50℃左右时，按照需要将培养基分装于培养皿，冷却，封装备用。
　　2.3 菌株的来源
　　实验所用的细菌菌株为一株表皮葡萄球菌（从长沙市某污水处理厂好氧池所取的活性污泥分离而来），并经实验室驯化鉴定得到，具有MeP降解特性，并命名为1a51。
　　2.4 实验方法
　　2.4.1 菌株1a51在R2A液体培养基中生长曲线的测定
　　为了解细菌1a51在R2A液体培养基中的各个生长期，用比浊度法测定了不同培养时間下的菌液浓度。于超净工作台火焰旁接种，用接种环从R2A固体培养基边缘取少量菌体，接种到含有100mL配置好待用的R2A液体培养基的锥形瓶里，置于28℃，160r/min的恒温气浴振荡器中培养，隔段时间取一定体积的菌悬液，测定其在600nm波长下的吸光度（OD600），确定菌株生长的迟缓期、对数生长期、稳定期和凋亡期。
　　2.4.2 菌株1a51对MeP降解特性的测定
　　在不同的培养条件下（温度、pH、底物浓度、金属离子）探究细菌1a51对MeP的降解。研究表明，培养温度、pH、额外碳源和底物浓度等条件被认为是影响各种难降解化合物的细胞生长、酶活性和降解能力的主要因素[7];为确保细菌的生物量和生长速度，目标物MeP在细菌的对数生长期（培养48h，OD600值为1.2左右）加入，继续保持原来的条件培养，加入目标物后定时（每隔1h）定量（每次取1mL）取样测定MeP的浓度;每组实验平行设置3个，目标物的加入和取样均在超净工作台里完成。
　　MeP的定性与定量：本实验用HPLC-UV法测定培养体系溶液中MeP的浓度，具体方法如下：样品取出后高速离心（10000r/min，10min），然后将上清液经过0.45μm水相针式滤膜，用1.5ml进样瓶收集滤液，直接进HPLC-UV仪器检测。仪器条件如下：流动相为甲醇：水（比例为70%∶30%），流速为1.5mL/min，进样体积25μL，检测波长254nm，以MeP的纯品定性，用外标法定量。
　　3 结果与讨论
　　3.1 菌株1a51在R2A液体培养基中的生长曲线
　　以菌株1a51的培养时间为横坐标，测定的OD600值为纵坐标，绘制出菌株的生长曲线，如图1。结果表明，菌株在培养16h后开始进入对数生长期，60h左右进入生长稳定期并且时间较短，随后开始进入凋亡期。
　　3.2 菌株对MeP降解的影响因素研究
　　3.2.1 细菌1a51对不同浓度MeP的降解
　　在所用的液体培养基的量一定的前提下，污染物加入的量对菌株的降解有较大影响。为了考察在加入不同浓度的MeP培养基里，菌株对污染物的降解率，实验选了5种不同的污染物浓度，分别是2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L，考察加入污染物后的6h的降解率。
　　如图2所示，随着加入的污染物浓度的提高，MeP的降解率逐渐降低，说明当浓度较低时，污染物的量是降解的决定性因素;当浓度提高到8mg/L—10mg/L时，降解率稳定在42%左右，说明当加入的目标物浓度较高时，菌株的生物量成为降解的决定性因素。
　　3.2.2 温度对1a51降解MeP的影响
　　温度通过影响菌株体内和体表的各种酶的活性进而影响细菌的生长和代谢，最终影响对目标物的降解。本实验选择4个不同的培养温度（15℃、25℃、35℃、45℃）下，考察目标物（初始浓度10mg/L，降解时间为6个小时）的降解;如图3所示，在低温（15℃）和高温（45℃）时，菌株活性较小，降解率较低，在35℃时降解效率达到56%左右，因此本实验的最佳实验温度设在35℃。
　　3.2.3 培养基pH对1a51降解MeP的影响
　　pH影响微生物的生长和代谢，因此几乎影响了所有的微生物反应过程。为探究菌株1a51对MeP降解的最佳pH，实验选取从酸性环境到碱性环境（pH=5—9）考察污染物（初始浓度10mg/L，降解时间为6个小时）的降解;如图4所示，在pH在5，6和9时，MeP的降解效率仅有10%左右，在中性环境下（pH=7），1a51具有最高的降解率达到32%左右，因此菌株1a51对MeP降解的最适pH为7。
　　3.2.4 金属离子对1a51降解MeP的影响
　　研究报道重金属的介入对难降解有机物的生物降解可能有一定的抑制作用，但同时也有报道显示重金属对于有机物的微生物降解具有一定的促进作用[8]。为探究重金属离子对菌株1a51降解污染物MeP的影响，实验选择了6种金属阳离子在两个不同的浓度（0.1mM和1mM）同样的时间（为了使金属离子充分混合溶解，延长降解时间至10个小时）里对MeP的降解率的影响。
　　如图5可以看出，不同的金属离子对降解的影响不同。与不加金属离子的空白组（BK）对比可以看出，在金属离子浓度为0.1mM时，各金属离子对MeP的降解主要是抑制作用，大致顺序为Ni2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Mn2+>Zn2+;而当金属离子浓度提高至1mM时，Mn2+和Cd2+的抑制效果更强，而Cu2+对MeP的降解有轻度的促进作用，Co2+和Ni2+的抑制作用有所减弱，在实验浓度下，Zn2+对1a51降解MeP没有明显影响。 　　4 结论
　　本文以从污水处理厂的活性污泥里分离出来的具有降解对羟基苯甲酸甲酯（MeP）能力的单体微生物细菌1a51为研究对象，对菌株的生长曲线及对防腐剂MeP的降解影响因素进行了探究。
　　结果表明：菌株1a51在R2A液体培养基里培养16小时后开始进入对数生长期，60小时左右进入稳定期，且稳定期较短，随即进入凋亡期。在菌株的对数生长期加入目标污染物MeP发现，随着加入的污染物的浓度的增加，相同时间内降解率逐渐降低，当污染物浓度达到8mg/L时，降解率稳定在42%左右;菌株降解MeP的最适温度为35℃，最适pH为7，在中性环境菌株活性较高。不同的金属离子对MeP的降解影响不同，对污染物的降解抑制作用最强的的Cd2+，Zn2+对污染物的降解几乎没有影响。
　　对羟基苯甲酸甲酯（MeP）作为一种典型的防腐剂，具有一定的内分泌干扰特性，本研究可以为环境中微生物去除防腐剂提供一定的指導;同时此研究目前只对MeP的降解进行了初步的研究，对其降解路径和机理还有待进一步研究。
　　参考文献：
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