产3—羟基丁酮菌株的分离·筛选与鉴定

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　　摘要 从土壤中分离获得一株高产3-羟基丁酮的菌株ME-N11。该菌株3-羟基丁酮转化率高，仅产生少量的2，3-丁二醇、乙醇、乙酸等副产物，具有重要开发应用价值。在对其形态特征及生理生化特性分析的基础上，采用PCR扩增了其16S rRNA基因，并进行了测序。基于该菌的生理生化特性与16S rRNA基因的同源性进行比较及系统发育分析，发现该菌株和Bacillus subtilis同源性达99%，命名为Bacillus subtilis ME-N11。
　　关键词 3-羟基丁酮；16S rRNA；系统发育；枯草芽孢杆菌
　　中图分类号 TS202.3 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）09-0001-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.001
　　Abstract An acetoin producing strain MEN11 was isolated from soil.The strain had a high acetoin conversion rate，and only produced a small amount of the corresponding byproducts，such as 2，3butanediol，ethanol and acetic acid.It showed a potential widely application in industry.16S rRNA gene sequence of the strain was then amplified by PCR，and its nucleotide was sequenced.Based on the analysis of its physiological and biochemical properties，homology and phylogenetic of 16S rRNA gene sequence，the strain showed 99% similarity with Bacillus subtilis，and was designated as Bacillus subtilis MEN11.
　　Key words Acetoin；16S rRNA；Phylogeny；Bacillus subtilis
　　3-羟基丁酮（3-Hydroxy-2-butanone）又名乙偶姻（acetoin）、甲基乙酰甲醇（acetylmethylcarbinol），天然存在于乳品和某些水果中，是一种应用广泛的食用香料，具有令人愉快的奶油香味，我国GB2760—86规定其允许食用，美国食品和萃取协会（FEMA）安全号为2008[1]。3-羟基丁酮作为香料应用范围极其广泛[2—3]，用量也很大。此外，3-羟基丁酮还可作为一种平台化合物，广泛应用于日化食品、制药、涂料、液晶材料等领域。2004年，美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一[4]，近年来，随着人们对3-羟基丁酮需求的不断增长，有关3-羟基丁酮的生产方法及应用研究已引起人们的广泛关注。
　　目前3-羥基丁酮的合成方法主要有2种：一是化学合成法，二是生物合成法。化学合成法存在产品收率低、环境污染较严重等缺点，而且其产品质量很难达到目前3-羟基丁酮的最大消费领域——食用香料的要求，更为严重的是化学合成法的原料大都是利用不可再生的化石资源，其原料来源受到限制[2]。相比而言，生物合成法可以摒弃化学合成法的这些缺陷，有望成为3-羟基丁酮合成的主要方法，据报道能够代谢产生3-羟基丁酮的菌株主要包括芽孢杆菌属（Bacillus）、克雷伯氏菌属（Klebisella）、肠杆菌属（Enterobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）以及乳球菌属（Lactococcus）等[2]。然而，在大多数菌株代谢过程中，3-羟基丁酮的积累量均较低，大都作为2，3-丁二醇的代谢副产物而产生。目前3-羟基丁酮高产菌株主要是芽孢杆菌属中的短小芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌[5-7]。考虑到从自然界直接分离高产菌株是3-羟基丁酮育种工作中最经济实用的方法，笔者采用自然选育，筛选获得了一株高产3-羟基丁酮的菌株，并对其进行鉴定。
　　1 材料与方法
　　1.1 产3-羟基丁酮菌株的筛选
　　1.1.1 主要培养基。
　　LB液体培养基：蛋白胨 10000 g/L，酵母膏5000 g/L，NaCl 5000 g/L。
　　LB固体培养基：蛋白胨 10000 g/L，酵母膏5000 g/L，NaCl 5000 g/L，琼脂20000 g/L。
　　Voges-Proskauer（V-P）培养基：蛋白胨 5000 g/L，葡萄糖 5000 g/L，K2HPO4 5000 g/L。发酵培养基：葡萄糖 100000 g/L，K2HPO4·3H2O 6.600 g/L，KH2PO4 2.000 g/L，（NH4）2HPO4 3.300 g/L，（NH4）2SO4 6.600 g/L，MgSO4·7H2O 0.250 g/L，FeSO4·7H2O 0.050 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 g/L，MnSO4·4H2O 0.001 g/L。
　　以上培养基如有需要加入0.2%～0.6%丙烯醇，pH均调至7.0～7.2，115 ℃灭菌30 min。
　　1.1.2 土样采集。
　　从江苏南京珍珠泉风景区、苹果园、草莓园等不同地点5～10 cm土层采集土样5份，采集好的土样立即带回实验室进行处理。
　　1.1.3 菌株分离。在菌株代谢过程中，3-羟基丁酮作为2，3-丁二醇的副产物而少量存在，通常积累浓度较低[8]。因此，从自然界中筛选出伴随还原态副产物2，3-丁二醇产量低的3-羟基丁酮高产菌株是实现3-羟基丁酮高效积累的有效途径。由于产芽孢的芽孢杆菌属是一类能够积累3-羟基丁酮的菌种，试验设计了从土样中通过加热富集筛选出产芽孢的细菌，再通过V-P （Vagex-Proskauer） 试验鉴定[9]，筛选出V-P阳性菌株（能够积累3-羟基丁酮），然后通过含丙烯醇的分离培养基分离出2，3-丁二醇脱氢酶活力较低的菌株（2，3-丁二醇脱氢酶催化微生物体内3-羟基丁酮和2，3-丁二醇之间的可逆反应；丙烯醇能够被醇脱氢酶还原为丙烯醛[10]，而丙烯醛对微生物细胞具有强烈的毒害作用，因此，醇脱氢酶活性高的菌株不能够在含有丙烯醇的分离培养基中存活，醇脱氢酶活性不高的菌株（能显著积累3-羟基丁酮）则能够在其中存活下来），最后通过发酵验证检测，最终筛选出伴随还原态副产物2，3-丁二醇产量极低的3-羟基丁酮高产菌株。 　　1.1.4 摇瓶发酵培养。
　　将上述挑选出的菌株转接至装有50 mL发酵培养基的摇瓶中，37 ℃，180 r/min培养48 h，对发酵液中3-羟基丁酮含量进行检测，先在520 nm下测定其吸光度，应用上述公式计算出3-羟基丁酮的量。3-羟基丁酮的产量高的菌株进一步利用液相色谱法检测验证[17]，挑选出产量高的菌株进一步试验。
　　1.2 测定项目与方法
　　1.2.1 生物量的测定。
　　利用UV1200型紫外分光光度计在波长600 nm处测定其吸光度（A600）。
　　1.2.2 葡萄糖浓度测定。
　　利用生物传感仪SBA-40C（山东省科学院生物研究所）测定葡萄糖浓度。
　　1.2.3 3-羟基丁酮定性测定。
　　3-羟基丁酮在碱性条件下氧化生成丁二酮，丁二酮与胍基化合物反应生成红色络合物，α-萘酚可促进该红色化合物的生成，可用于3-羟基丁酮的定性检测。 该红色化合物在波长520 nm处有最大吸收，颜色的深浅与溶液中丁二酮和3-羟基丁酮的浓度呈线性关系，可用于测定3-羟基丁酮的含量[11]。
　　1.2.4 3-羟基丁酮定量测定。
　　3-羟基丁酮浓度检测[12]：利用DIONEX P680液相色谱仪检测。色谱分离柱：BioRad公司Aminex HPX-87H離子色谱柱（300 mm×7.8 mm，）；检测器：SHODEX RI-101折光示差检测器；流动相：5 mmol/L H2SO4水溶液；流动相流速：0.5 mL/min；进样量：20 μL；柱温：65 ℃。
　　1.3 菌株鉴定
　　1.3.1 菌株生理生化特征及形态学观察。
　　①在光学显微镜下观察菌体形态特征。
　　②参照《常见细菌系统鉴定手册》《微生物学实验手册》《Bergey细菌鉴定手册》和《芽孢杆菌生物学及其应用》上的鉴定方法[13-15]。
　　1.3.2 细胞全基因组的提取。按照细菌基因组提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0）的操作步骤提取细菌的全基因组。
　　1.3.3 16S rRNA基因的扩增。
　　采用细菌16S rRNA基因通用引物进行扩增，引物序列：
　　正向引物BSF（8/20）5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物BSR（1541/20）5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。
　　1.3.4 PCR扩增条件。
　　PCR反应体系：DNA模板2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，ddH2O 15.3 μL，MgCl2 （25 mmol/L） 1.5 μL，dNTP-mix 2.0 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，Taq酶0.3 μL，总反应体积为25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性 4 min；30个循环；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s；最后72 ℃保温10 min，反应结束后4 ℃保存。
　　1.3.5 PCR产物的克隆与16S rRNA基因序列测定。
　　采用TaKaRa胶回收试剂盒（Takara Argarose Gel DNA purification Kit version 2.0）纯化PCR产物，琼脂糖凝胶电泳验证。纯化后的PCR产物连接到测序载体pMD 18-T Simple，转化E.coli TG1。提取质粒，经过蓝白斑筛选后挑选出阳性克隆菌株培养用于测序。基因测序由南京金斯特生物科技有限公司完成。
　　1.3.6 同源性比较、系统发育树的构建。
　　将已测出的部分16S rRNA （1 540 bp）基因序列运用NCBI的BLAST程序比对数据库中芽孢杆菌属的16S rRNA基因，分别选择不同种中相似性高的菌株用于系统发育树的构建，系统发育树用Mega 4.0软件构建完成。
　　2 结果与分析
　　2.1 筛选结果
　　设计了一种培养基加有不同浓度丙烯醇，从各地土壤样品中初筛分离得到300株菌，并通过3-羟基丁酮定性检测，得到120株产3-羟基丁酮的菌株。分别测定筛选获得菌株的生物量和发酵液中3-羟基丁酮含量，大部分集中于中等水平，高水平的较少，结果见表1，其中ME-N11菌株3-羟基丁酮含量相对较高。该菌株生长速度快，3-羟基丁酮产量较稳定，为进一步育种与构建高产基因工程菌株奠定良好基础。
　　2.2 菌株形态学特征
　　菌株ME-N11为杆状，宽0.7～0.8 μm，长2～3 μm，有侧生鞭毛，革兰氏染色阳性。该菌在平板中培养前期菌落表面光滑湿润，在培养后期菌落边缘起皱（图1）。
　　2.3 菌株生理生化特征
　　菌株ME-N11为好氧菌，能在2%～7% NaCl浓度下生长，在10% NaCl浓度下不能生长。生长的最低温度为10 ℃，最适温度为35 ℃，最高生长温度为50 ℃。具有淀粉酶、过氧化氢酶活性，不具有卵黄卵磷脂酶活性。能够利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、柠檬酸盐。能够水解明胶、酪蛋白、淀粉和还原硝酸盐。不产生吲哚，将其与芽孢杆菌属中典型种Bacillus subtillus的生理生化特征进行比较，结果见表2。
　　2.4 系统发育树的构建
　　PCR获得了ME-N11菌株 16S rRNA基因的部分片段，长度为1 540 bp（图2），经纯化和测序获得了该片段的序列，利用BLAST程序与NCBI数据库中的基因序列进行比对，基于相关同源性高的菌株16S rRNA基因序列构建系统发育树（图3），结果表明，其序列与ApetroaieConstantin等[16]报道的Bacillus subtilius 16S rRNA基因序列相似性最高（NCBI数据库资料），达99%。ME-N11菌株的16S rRNA基因序列在GenBank数据库中的登入号为GQ303255。 　　3 結论与讨论
　　该研究从土壤中筛选获得120株产3-羟基丁酮菌株，进一步筛选挑选出产量较高菌株ME-N11，该菌株通过16S rRNA基因序列分析法鉴定发现与枯草芽孢杆菌的16S rRNA基因序列同源性达99%，与常规生理生化特征试验结果相吻合。利用糖质原料发酵产3-羟基丁酮菌株已有大量报道，其中3-羟基丁酮大多作为2，3-丁二醇的代谢副产物。
　　然而以3-羟基丁酮为主要产物的菌株鲜有报道。目前对该菌株结构特点、理化特性还在进一步研究中。通过对该菌发酵条件的优化以及菌种改良等措施，进一步提高3-羟基丁酮的产量是今后研究的主要方向。
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