Cdh1和Num1过表达菌株的构建

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　　摘要 [目的]研究Cdh1和Num1之间是否存在相互作用，构建用于Cdh1和Num1免疫共沉淀试验的过表达菌株。[方法]首先在酵母菌株YWL630中用GAL1和3HA对CDH1进行标记，构建GAL1-3HA-CDH1 NUM1-GFP菌株，再利用酵母四分体解离的方法使菌株YWL63和YWL490分别与该菌株杂交并进行四分体解离，从而得到所需菌株。[结果]成功构建不同基因型和配型的重组酵母菌株，其中YT52成功过表达了约340 kD的Num1，YT53成功过表达了340 kD的Num1和75 kD的Cdh1，YT57成功过表达了75 kD的Cdh1。[结论]经过同源重组的方法成功标记CDH1并诱导蛋白过表达，通过酵母四分体解离的方法构建用于Cdh1和Num1互作试验的过表达菌株，为揭示APC/C是否介导Num1的降解及机制奠定基础。
　　关键词 过表达;酵母四分体解离;Cdh1;Num1
　　中图分类号 Q26文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）10-0001-04
　　Abstract [Objective] To study whether there is an interaction between Cdh1 and Num1， and construct an overexpression strain for Cdh1 and Num1 coimmunoprecipitation experiments. [Method] Firstly， CDH1 was labeled with GAL1 and 3HA in yeast strain YWL630 to construct GAL13HACDH1 NUM1GFP strain， and then yeast YWL63 and YWL490 were hybridized with the strain by yeast tetrad dissection method. The tetrad dissection was carried out to obtain the desired strain. [Result] The recombinant yeast strains with different genotypes and mating types were successfully constructed. YT52 successfully overexpressed Num1 with a size of about 340 kD. YT53 successfully overexpressed 340 kD Num1 and 75 kD Cdh1， and YT57 successfully overexpressed 75 kD of Cdh1. [Conclusion]The method of homologous recombination successfully labeled CDH1 and induced protein overexpression， and constructed an overexpression strain for Cdh1 and Num1 interaction experiments by yeast tetrad dissection thereby laying the foundation for revealing whether APC/C mediates the degradation of Num1 and its mechanism.
　　Key words Overexpression;Yeast tetrad dissociation;Cdh1;Num1
　　在不对称细胞分裂期间，有丝分裂纺锤体必须正确适当地定向，以确保细胞命运决定因子准确地分配到每个子细胞[1]。在芽殖酵母的有丝分裂中，细胞膜锚定的dynein对细胞质微管施加拉力，将有丝分裂纺锤体移动到芽体颈部，而dynein的锚定则需要Num1[2]。Num1（nuclear migration 1，核迁移）[3-5]是一个313 kD的大分子蛋白质，含有N-末端卷曲螺旋（CC）结构域，中间一个EF hand motif，12个由64个氨基酸组成的重复区域以及C-末端pleckstrin同源性（PH）结构域[6]。Num1定位于细胞膜，并与dynein相互作用。其中，CC结构域直接与线粒体膜相互作用，也是Num1和动力蛋白相互作用所必需的，而与PI4，5P2高度特异性结合的PH结构域将Num1錨定到细胞质膜上[6-10]。
　　APC/C（anaphase-promoting complex）是一种多亚基E3泛素连接酶，负责细胞周期调节蛋白在中期到后期和有丝分裂期到G1期过渡中的泛素化[11-13]。APC/C在细胞周期的不同阶段分别由2种特异性激活因子Cdh1和Cdc20调控[14-15]，只有与共激活因子相结合时，APC/C在细胞周期中才能起到泛素化Cyclins的作用。研究表明，具有活性的APC/C作用底物具有2种共同的降解基序：D box和KEN motif。这些底物通过这种降解基序特异性结合APC/C及其共激活因子复合物[16-18]。
　　前期通过对Num1进行序列分析，发现Num1序列中包含数个分别与APC的激活蛋白Cdh1和Cdc20结合的保守基序KEN motif和D box，意味着Num1的降解可能与APC/C有关。因此，通过检测APC共激活因子与Num1之间有无相互作用，进而了解APC/C是否可能介导Num1的降解。该研究利用同源重组原理先在YWL630菌株中成功构建Gal-3HA-Cdh1重组蛋白，接着采取酵母四分体解离的方法构建COIP所需过表达菌株。在利用四分体分析技术的研究中，常采用酿酒酵母作为试验对象。2个配型不同的亲代酵母菌株杂交而产生4个黏在一起的子代酵母，称为四分体。为了使这个四分体分开称为4个单独的孢子，利用四分体解离显微镜在物理上进行孢子解离，继而经过筛选获得不同基因型。 　　笔者通过构建过表达Cdh1和Num1菌株，通过免疫共沉淀试验检测Cdh1和Num1的相互作用，旨在为揭示APC/C是否介导Num1的降解及机制奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 菌株。
　　DH5α大肠杆菌细胞（北京鼎国昌盛）;酿酒酵母YWL630基因型：MATa Num1-yEGFP∷spHIS5 ura3-52 lys2-801 leu2-Δ1 his3-Δ200 trp1-Δ63;YWL490基因型：MATα TRP1-GAL1-Num1-YFP-HIS ura3-52 lys2-801 leu2-Δ1 his3-Δ200 trp1-Δ63;YWL63基因型：MATα DYN1-3GFP∷TRP1 ura3-52 lys2-801 leu2-Δ1 his3-Δ200 trp1-Δ63;质粒PFA6a-TRP1-GAL1-3HA。
　　1.1.2 培养基及试剂。
　　YPD培养基和缺乏相应氨基酸的SD（synthetic define）培养基;LithiumSorb溶液：10 mmol/L LioAC，100 mmol/L Sorbitol，10 mmol/L Trisbase，1 mmol/L EDTA，pH 8.0;PEG溶液：10 mmol/L LioAC，40% PEG，10 mmol/L Trisbase，1 mmol/L EDTA，pH 8.0;转膜液：190 mmol/L Glycine，0.05% SDS，25 mmol/L Trisbase，10%甲醇;TBST溶液：300 mmol/L NaCl，50 mmol/L Trisbase，0.05% Tween 20，pH 8.0。
　　1.2 方法
　　1.2.1 GAL1-3HA-CDH1 NUM1-GFP菌株的构建。
　　1.2.1.2
　　酵母感受态的制备。从-80 ℃冰箱将菌株拿出在YPD固体培养基上划线置于30 ℃恒温培养箱培养1～2 d后，挑菌至3 mL YPD液体培养基中放置于30 ℃摇床，200 r/min培养24 h左右;次日吸取3 μL菌液至新的30 mL YPD液体培养基中，30 ℃，200 r/min摇床中培养至对数期（OD600为0.6左右）即可收集;将30 mL对数期生长的YWL630细胞3 000 r/min离心3 min后弃上清，用10 mL灭菌水清洗细胞，3 000 r/min离心1 min弃上清。再用3 mL LithiumSorb溶液悬浮细胞，3 000 r/min离心2 min，吸弃上清;向沉淀中加入360 μL LithiumSorb和40 μL鲑鱼精子DNA（作为载体DNA，制备感受态之前将其在沸水中煮10 min后放回冰上冷却至0 ℃）悬浮细胞，再分装到新的1.5 mL EP管中，每管100 μL左右，放置在-80 ℃保存。
　　1.2.1.3 转化。从-80 ℃冰箱将近期制备的YWL630感受态取出置于冰上，接着吸取10 μL用于转化的PCR产物加入到100 μL 感受态细胞中轻轻混匀，再加入600 μL PEG溶液混匀，在室温下静置30 min;加入38 μL二甲基亚砜（DMSO）混匀后在42 ℃水浴中热激5 min;3 000 r/min离心2 min，吸弃上清;向白色沉淀中加入50 μL灭菌水重悬细胞，将细胞均匀涂布在含有G418（0.02 mg/mL）抗性的YPD固体培养基上，用封口膜封口并倒置在30℃恒温箱培养2～3 d等待克隆长出。
　　1.2.1.4 克隆的筛选。待单克隆长出后，挑取其中数个划线在筛选固体培养基上置于30 ℃培养，此为第一次划线;等待2～3 d克隆长出后，重复一次划线，此为第二次划线。从第二次划线的培养基上挑取4个克隆扩大培养，待提取总蛋白进行鉴定。
　　1.2.2 重组转化子的过表达鉴定。
　　1.2.2.1 酵母过表达菌株的细胞培养。从-80 ℃冰箱将菌株取出，在YPD固体培养基上划线并置于30 ℃恒温培养箱培养1～2 d;待克隆长出后，第1天挑取适量菌落至3 mL YPD液体培养基中并放置于30 ℃摇床，200 r/min培养24 h左右;细胞长至饱和后，吸取4 μL菌液至含2%（W/V）棉子糖（Raffinose）的液体YPA培养基中，置于摇床中200 r/min、30 ℃培养16 h;接着将细胞3 000 r/min离心1 min后弃上清，向沉淀中加入含2%（W/V）半乳糖（Galactose）的液体YPA培养基，继续置于30 ℃摇床中培养4 h左右即可收集细胞。
　　1.2.2.2 TCA法提取总蛋白。从培养好的对数期细胞中吸取1.5 mL菌液至1.5 mL收集管中，3 000 r/min离心2 min后弃上清继续3 000 r/min离心1 min，吸弃上清并收集沉淀;向沉淀中加入100 μL 20%的三氯乙酸（TCA）重悬混匀后，再加入直径1 mm的玻璃珠至与液面相平，放在冰上静置短暂时间;室温下用细胞振荡破碎仪破碎2 min，其中每破碎1 min后即刻将收集管在冰上静置冷却1 min;接着用针头在收集管底部戳一个小孔，并将其插入另一个新的1.5 mL EP管中，置于4 ℃冷冻离心机中3 000 r/min离心3 min后丢弃装有玻璃珠的收集管;继续将装有细胞裂解液的1.5 mL EP管3 000 r/min離心5 min后，收集沉淀;向白色沉淀中加入40 μL 2x Protein Loading Buffer和40 μL Tris-HCl（pH 8.0），用移液器吹打混匀后，封口膜封口并继续静置于冰上;将离心管放置于煮沸的100 ℃水中煮5 min后，12 000 r/min离心1 min，上清用于蛋白质免疫印迹分析或保存在-20 ℃备用。 　　1.2.2.3 Western Blot分析。
　　在常規的蛋白免疫印迹分析中，蛋白经10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳（SDS-PAGE，配方见表1）分离后，使用半干转膜仪在含10%甲醇的转膜液中转移到PVDF膜上。蛋白膜用含5%脱脂奶粉的TBST溶液浸泡轻摇1 h后用HA抗体（THETMc-HA Tag Antibody，mAb，Mouse，GenScript）或GFP抗体（Mouse Anti GFP Monoclonal-Antibody，兴华基因）室温下孵育2 h，TBST溶液洗涤3次，每次10 min，再用二抗室温下孵育1 h。结合了抗体的蛋白膜用TBST溶液洗涤3次，每次10 min，随后用ECL超敏化学发光试剂盒染色，再用凝胶成像仪曝光检测。
　　1.2.3 重组菌株基因组DNA的提取及PCR鉴定。
　　1.2.4 酵母四分体解离法构建重组过表达菌株及表达鉴定。
　　（1）亲代酵母菌株的杂交：将-80 ℃冰箱取出的酵母菌株YT23（α）、YWL63（a）、YWL490（a）在YPD固体培养基上划线，倒置30 ℃恒温箱培养1～2 d;待菌落长出后，用1 mL枪头分别挑取配型不同的YT23和YWL63以及YT23和YWL490一小块菌落混匀在新的YPD培养基上，30 ℃恒温箱培养24 h后用枪头挑取适量菌落转移至3 mL SPM液体培养基中，30 ℃、200 r/min培养3～4 d。
　　（2）酵母细胞壁的处理：吸取70 μL细胞液3 000 r/min离心1 min收集沉淀，加入100 μL Lisorb和7.5 μL Zymolase轻轻混匀。37 ℃恒温箱处理8 min 30 s，吸取20 μL滴至YPD固体培养基一侧使之从上往下顺流，待菌液稍干即可用于四分体的解离。
　　（3）四分体的解离和筛选：使用酵母解离显微镜MSM400操作系统对四分体进行分离，详细步骤见Singer MSM System 400说明书，完成后置于30 ℃恒温箱培养1～2 d。为了筛选所需要的基因型：GAL1-NUM1-YFP、GAL1-NUM1-YFP GAL1-3HA-CDH1、GAL1-3HA-CDH1，将YPD培养基上生长的孢子复制到SD-HIS、SD-TRP、含G418（20 mg/mL）抗性的YPD以及SC固体培养基上，30 ℃恒温箱培养2～3 d，具体筛选情况见表2。
　　（4）将筛选得到的菌落转移至3 mL YPD液体培养基中培养，收集对数期细胞提取总蛋白并进行Western Blot鉴定。
　　2 结果与分析
　　2.1 GAL-3HA-Cdh1 Num1-GFP重组菌株的构建和表达鉴定
　　3 结论与讨论
　　该研究旨在构建过表达Cdh1和Num1的重组菌株用于后期试验。首先在CDH1位点前插入过表达启动子、蛋白标签和筛选标记，通过半乳糖诱导使该蛋白过表达，成功构建了GAL-3HA-CDH1 NUM1-GFP重组菌株。使用酵母四分体解离技术的方法构建了不同基因型的重组菌株，并从中筛选研究中所需要的菌株，经过Western Blot分析，已验证Cdh1和Num1蛋白成功过表达且每个菌株中基因型也是正确的。
　　该试验中，根据酵母菌株的构建总结了以下经验：首先需要熟练掌握同源重组原理设计扩增引物用于转化插入基因组正确位点。其次，每一个步骤均要严格控制，如缺陷型固体培养基的配制、引物扩增的条件、感受态的制备和转化等过程中细节的控制十分重要。另一方面，四分体解离的方法与同源重组转化的方法相比，该方法步骤简单，试验周期较短，成功率较高。此方法的熟练使用为以后重组菌株的构建提供了便利，重组蛋白的成功构建为Num1 在细胞周期中的作用机制奠定了基础。
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