耐高温蛋白酶高产菌株的选育
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摘 要：本研究采用紫外线诱变育种的方法，选育耐高温蛋白酶高产菌株。试验结果表明，经过牛奶平板初筛和酶活测定复筛，得到菌株A2的酶活为525.56U/mL，与初始菌株相比，其酶活提高了34.26%。菌株A2经过5次代传酶活力在519.12～538.23U/mL之间，具有较好的遗传稳定性。
关键词：耐高温蛋白酶;紫外诱变;地衣芽孢杆菌
中图分类号：S-3 文献标识码：A
DOI：10.19754/j.nyyjs.20200330004
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。蛋白酶是酶学研究中最早也是最深入的一种酶，到21世纪初已经报道的蛋白酶超过900种[1]。蛋白酶在洗涤、纺织、酿造、化工、环保、食品和饲料等行业都得到了广泛应用，是一种非常重要的商业化酶制剂，其市场份额占酶制剂市场的首位。耐高温蛋白酶具有很好的热稳定性，在许多领域显示出更好的应用前景，已成为国内外蛋白酶研究领域的热点。
国内对耐高温蛋白酶进行了大量的研究，尹春筱[2]等从云南腾冲热泉中分离出产耐高温蛋白酶的嗜热芽孢杆菌;廉立慧[3]等从温泉中筛选出产耐高温蛋白酶的短芽孢杆菌;王丽[4]等从酒曲中分离出产耐高温蛋白酶的芽孢杆菌;母智深[5]等以乳粉为样品筛选出产耐高温蛋白酶的荧光假单孢杆菌。尽管国内发现了大量的产耐高温蛋白酶的菌株，但以上菌株产酶能力不强。因此，选育耐高温蛋白酶高产菌株对耐高温蛋白酶的生产应用具有重要价值。
本团队从湛江湖光岩玛珥湖地区筛出1株产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌HL-3，所产耐高温蛋白酶的最适作用温度为70℃，最适pH為7.0，在90℃环境保温10min后酶活力仍可保留75.12%[6]。本文以上述菌株为研究基础，通过紫外诱变的方法选育高产菌株，以期为耐高温蛋白酶的发酵生产提供优良菌株。
1 材料与方法
1.1菌种
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）HL-3，广东海洋大学食品科技学院微生物工程实验室保藏。
1.2 试剂与原材料
豆粕购买于广州亿永粮油集团有限公司，粉碎后过60目筛备用;奶粉为澳大利亚德运脱脂奶粉;福林酚试剂购于上海联迈生物工程有限公司;其它常规试剂为国产分析纯。
1.3 培养基
营养肉汤培养基：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g、葡萄糖1g、蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
营养琼脂培养基：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g、葡萄糖1g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
牛奶培养基：脱脂奶粉10g、琼脂2g、蒸馏水100mL，100℃灭菌10min。
产酶培养基：豆粕10g、葡萄糖0.5g、蒸馏水100mL，121℃灭菌20min。
1.4 实验方法
1.4.1 蛋白酶酶活测定方法
按李婵娟等的方法[7]进行，用pH为7.0的缓冲液，反应温度为50℃。酶活单位定义：1mL酶液在特定条件下每分钟水解酪蛋白溶液生成1μg酪氨酸所需要的酶量定义为1个酶活单位U。
配制500μg/mL的酪氨酸标准溶液，然后将此标准液分别稀释到浓度为0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL。分别取上述稀释液各1mL加入到试管中，然后往每只试管加0.5%酪蛋白溶液2mL，放入50℃水浴中保温20min，再加入10%三氯乙酸3mL，混匀;将每个试管都倒入滤纸中进行过滤，收集滤液;取滤液1mL于1支试管中，然后再加0.55mol/LNa2CO3溶液5mL和福林酚试剂1mL，放入50℃水浴中显色15min;用不含酪氨酸溶液的试剂作为对照，在680nm波长下测定吸光度;以吸光值为横坐标，酪氨酸的质量为纵坐标，绘制标准曲线。
将发酵液于8000r/min离心10min，收集上清液作为粗酶液，然后将粗酶液用蒸馏水稀释到合适的倍数;各取1mL稀释后的粗酶液分别置于2支试管中，1支作为待测管，另1支为对照管。将待测管和装0.5%酪蛋白溶液的试剂瓶都置于50℃水浴锅中预热10min，然后将0.5%酪蛋白溶液加2mL到待测管中，于50℃水浴锅中继续保温20min;取出后向待测管中加入10%的三氯乙酸3mL，混匀;将待测管倒入滤纸中进行过滤，收集过滤液。取1mL过滤液放入1支新试管中，再加5mL0.55mol/LNa2CO3溶液和1mL福林酚试剂，放入50℃水浴锅中显色15min。对照管的操作方法同待测管，只是在加酪蛋白之前先加10%的三氯乙酸3.0mL，使其酶失活，再加入酪蛋白。用对照管调零，并在680nm波长下测定吸光值，并根据标准曲线和稀释倍数来计算蛋白酶的酶活。
1.4.2 菌株紫外诱变的方法
将斜面保藏的地衣芽孢杆菌HL-3接种于盛有30mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，于50℃恒温摇床中，120r/min培养16h;然后于5000r/min离心10min，弃去上清液，打匀沉淀，加入生理盐水，稀释为细胞浓度约为108CFU/mL的菌悬液。
先将紫外灯进行预热30min，然后将3mL制备的菌悬液加入到无菌培养皿内，开启培养皿盖后，在磁力搅拌的条件下，紫外线照射分别为0s、30s、60s、90s、120s和150s，每个处理重复3次。
在暗室红灯下将紫外线处理后的菌悬液用无菌水进行10倍稀释至合适的稀释度，然后涂布于牛奶培养基上;将所有培养皿用黑色纸包扎，于50℃培养箱中培养24h。计算不同照射时间下的致死率，观察并测量对照组和处理组的菌落透明圈，测定透明圈直径（D）和菌落直径（d），计算两者的比值。选取D/d较大的菌落菌株转接到营养斜面培养基上，于50℃培养24h作为初筛菌种;将初筛挑选的菌株挑取一环接种至产酶培养基中，装液量为30mL/250mL，于50℃、120r/min振荡培养24h后测定发酵液的酶活，筛选出酶活最高的菌株作为所筛菌株。 1.4.3 致死率的测定
紫外线物理诱变后菌株的致死率计算公式[8]如下：
致死率（%）=[（未诱变平板菌落数-诱变后平板菌落数）/未诱变平板菌数]×100
1.4.4 选育菌株遗传稳定性实验
将最终筛选的高产突变菌株进行5次遗传代传，依次接种一环至产酶发培养基中，装液量为30mL/250mL，于50℃、120r/min振荡培养24h后测定各代传的耐高温蛋白酶活力。通过比较不同代传的酶活力，判断其高产酶特性能否稳定地遗传。
2 结果与分析
2.1 紫外照射时间对致死率的影响
对诱变菌株的每个紫外照射时间的致死率进行计算，结果如表1所示。由表1结果可知，随着紫外照射时间的增加，诱变菌株的致死率不断增加，这与薛健[9]等的研究一致。
2.2 紫外诱变筛选结果
通过紫外照射共筛选得到108株突变菌株，在这108株突变菌株中，根据D/d值的大小筛选出其值较大的4株作为初筛菌株，并将初筛进行发酵产酶复筛，结果如表2所示。由表2结果可知，菌株A2的蛋白酶酶活最高，为525.56U/mL;菌株A1、A3和A4所产蛋白酶分别为502.36U/mL、512.33U/mL和508.72U/mL;而作为对照的初始菌株A0所产蛋白酶酶活为391.25U/mL;菌株A2与初始菌株相比，其酶活提高了34.26%。
2.3 高产菌株稳定性实验
菌株A2不同遗传代数的耐高温蛋白酶酶活如图1所示。由图1结果可知，A2经过5次代传酶活力在519.12～538.23U/mL之间，酶活力波动范围在2%以内，表明该菌株具有良好的遗传稳定性。
3 结论
本实验以地衣芽孢杆菌HL-3为初始菌株，通过紫外诱变筛选得到菌株A2，其酶活为525.56U/mL，与初始菌株相比，酶活提高了34.26%。菌株A2经过5次代传酶活力在519.12～538.23U/mL之间，具有较好的遗传稳定性。
参考文献
[1] 胡学智，王俊.原料乳中产耐高温蛋白酶菌株的筛选与鉴定[J].工业微生物，2008，38（4）：49-61.
[2]尹春筱，李江，徐玲玲.一株产高温蛋白酶嗜热菌A-2的筛选鉴定及酶学特性分析[J].基因组学与应用生物学，2019，38（7）：3051-3056.
[3]廉立慧，高丽君，王德才，等.高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析[J].生物技术通报，2011（3）：175-179.
[4]王丽，韩建荣，赵景龙，等.汾酒曲醅中产高温蛋白酶芽孢杆菌的分离[J].中国酿造，2009（1）：67-69.
[5]母智深，白英.原料乳中产耐高温蛋白酶菌株的筛选与鉴定[J].中国乳品工业，2009，37（10）：24-26.
[6]刘唤明，张芷欣，洪鹏志，等.耐高温蛋白酶产生菌的筛选及酶学特性的初步研究[J].食品工业科技，2017，38（3）：133-136.
[7]李婵娟，王婧，杨洁.蛋白酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究[J].湖北农业科学，2015，54（19）：4794-4797.
[8]赵斌，何紹江.微生物学实验[M].北京：科学出版社，2002：187-191.
[9]薛健，王欢.纳豆激酶生产菌的紫外诱变选育[J].农业与技术，2016，36（21）：4-5.
（责任编辑 李媛媛）
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