NCAM在成年大鼠视神经再生模型中的表达及分布与其再生作用研究

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　　摘要：目的  探討神经细胞黏附分子（NCAM）在成年大鼠视神经再生模型中的表达、分布及其在视神经再生中的作用。方法  购置健康、雄性SD大鼠32只，随机取SD大鼠8只设为空白对照组;剩余24只大鼠采用Aβ25-35寡聚体致伤SD大鼠海马CA1区，建立阿兹海默症（AD）动物模型，并构建大鼠视神经再生模型，建模成功后随机分为模型对照组（n=8只）、NSCs移植组（n=8只）及NCAM1基因修饰神经干细胞（NSCs）移植组（n=8只）。空白对照组和模型对照组注入等体积的生理盐水，NSCs移植组植入NSCs细胞，细胞数量3×105/L;NCAM1基因修饰NSCs移植组注入NCAM1基因修饰NSCs的细胞，细胞数量3×105/L，各组均完成7 d干预，比较各组学习和记忆能力、组织学检测、海马CAI区神经元形态、NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA表达。结果  NCAM1基因修饰NSCs移植组潜伏期短于NSCs移植组和模型对照组，原平台象限内停留时间、穿环次数均长（多）于NSCs移植组和模型对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;HE染色结果表明，NCAM1基因修饰NSCs移植组、NSCs移植组视神经损伤下对较轻，且NCAM1基因修饰NSCs移植组视神经损伤不明显;NCAM1基因修饰NSCs移植组NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于NSCs移植组和模型对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  NCAM在成年大鼠视神经再生模型中呈低表达，经NCAM基因修饰NSCs移植用于成年大鼠视神经再生模型中可提高NCAM的表达，有助于促进视神经再生。
　　关键词：神经细胞黏附分子;视神经再生模型;视神经再生;神经干细胞;阿兹海默症
　　Abstract：Objective  To investigate the expression and distribution of nerve cell adhesion molecule （NCAM） in the optic nerve regeneration model of adult rats and its role in optic nerve regeneration. Methods  32 healthy and male SD rats were purchased， and 8 SD rats were randomly selected as a blank control group; the remaining 24 rats were injured by Aβ25-35 oligomers in hippocampal CA1 area of SD rats to establish Alzheimer's （AD） animal model， and build rat optic nerve regeneration model， after successful modeling， randomly divided into model control group （n=8）， NSCs transplantation group （n=8） and NCAM1 gene modified neural stem cells （NSCs） transplantation Group （n = 8）. The blank control group and the model control group were injected with equal volume of normal saline. The NSCs transplantation group was implanted with NSCs cells， the number of cells was 3×105/L; the NCAM1 genetically modified NSCs transplantation group was injected with NCAM1 genetically modified NSCs， and the number of cells was 3×105/L. Each group completed a 7 d intervention to compare the learning and memory abilities， histological examination， neuronal morphology of the hippocampal CAI area， NCAM， ERK1/2， JNK and P38 mRNA expressions in each group.Results  The latency of NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group was shorter than that of NSCs transplantation group and model control group. The residence time and the number of looping times in the original platform quadrant were both longer （more） than those of NSCs transplantation group and model control group，the differences were statistically significant （P<0.05）; HE staining results showed that： NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group， NSCs transplantation group had less optic nerve damage， and NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group had less obvious optic nerve injury; NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group NCAM， ERK1/2， JNK and P38 mRNA levels were higher than NSCs transplantation group and model control group， the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion  NCAM has a low expression in the model of optic nerve regeneration in adult rats. Transplantation of NSCs modified with NCAM gene for the model of optic nerve regeneration in adult rats can increase the expression of NCAM and help promote the regeneration of optic nerve. 　　阿兹海默症（AD）是一种以进行性认知功能障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病[1]。目前临床上对于AD病因尚未阐明，世界各国缺乏AD发生、延缓或阻止的有效方法和药物[2]。因此，有效的药物干预成为当前研究的热点。研究表明[3]，中枢神经系统在损伤和退行性变后自身修复能力有限，而神经干细胞（NSCs）作为神经组织发育和自我修复的功能性细胞成為该领域研究的焦点。NSCs是一种具有分裂、增殖及定向分化潜能的细胞，对疾病、损伤具有反应能力[4]。同时，该细胞具有自我更新能力，能保证脑内细胞数量。既往研究表明[5]，NSCs移植用于AD中能进行激活、增殖与分化，从而形成具有功能的神经元，能治疗海马区功能障碍。而NSCs移植效果很大程度上取决于宿主神经元形成突触连接并建立回路，且该方法难以克服局部致伤环境对移植细胞成功率的影响[6]。神经细胞黏附分子（NCAM）是一种细胞表面糖蛋白，广泛存在于神经系统中，能直接参与海马的突触等神经生理功能[7]。基于此，本研究以健康、雄性SD大鼠为对象，探讨NCAM在成年大鼠视神经再生模型中的表达及分布及其在视神经再生中的作用，报道如下。
　　1资料与方法
　　1.1实验动物  于2018年6月～2019年4月购置健康、雄性SD大鼠32只作为对象（购置于上海斯莱克实验动物有限责任公司），动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005，体重180～220 g，平均体重（200.73±25.91）g。随机取SD大鼠8只，设为空白对照组;剩余24只大鼠采用Aβ25-35寡聚体致伤SD大鼠海马CA1区，建立AD动物模型，并构建大鼠视神经再生模型，建模成功后随机分为模型对照组（8只）、NSCs移植组（8只）及NCAM1基因修饰神经干细胞（NSCs）移植组（8只）。小鼠实验前适应性喂养1周，控制室内湿度40%～60%，温度20～24℃。
　　1.2 仪器与设备  Trizol Reagent（美国Incitrogen公司）、miRNA RT-PCR试剂盒（上海生工生物）、酶标仪（芬兰Thermo Labsystem公司）、台式低温离心机，型号：Eppendroff 5810R（德国）、ABIPRISM 7000HT荧光定量PCR仪（美国ABI公司）、GOS7500型凝胶成像分析系统（美国UVP公司）、倒置显微镜（奥林巴斯公司）、化学发光凝胶成像系统（美国 Bio-rad 公司）、PBS（北京中杉金桥公司）、水迷宫（淮北正华生物仪器设备有限公司）。
　　1.3方法
　　1.3.1建模方法  空白对照组建立后，取剩余24只大鼠，采用Aβ25-35寡聚体致伤SD大鼠海马CA1区，建立AD动物模型，并构建大鼠视神经再生模型。Aβ25-35寡聚体制备：将Aβ25-35和六氟异丙醇（HFIP）提前放在冰盒上预冷，每1 mg Aβ25-35加入220 μl HFIP，该步骤在冰上操作。盖上管盖在室温放置60 min，使Aβ25-35充分溶解。将溶解好的Aβ25-35放回冰上10 min后置于通风橱内挥发、过夜[8]。次日打开通  风橱排风2 h。大体可见片状沉淀。在超净台内向     其离心管加入44 μl二甲基亚砜，吹打混匀后，每 管加9386 μl无酚红DMEM/F12培养基。4℃孵    育24 h。隔日低温离心机4 ℃、12000 r/min离心  10 min后，转移上清液至新管，分装放入-20 ℃冰 箱储存，储存浓度为100 μmol/L，原子力显微镜鉴 定Aβ25-35寡聚体。大鼠适应1周后，10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，将大鼠固定在立体 定向仪上。采用BAS立体定向仪，海马定位参照Giovannelli等的方法。头部备皮，常规消毒海，马定位前囟后3.0 mm，中缝旁开2.0 mm，硬膜下2.9 mm。钻开颅骨后，用微量进样器5 min内缓慢注入Aβ25-35寡聚体5 μl，注射完毕后，针在里面停留25 min，缓慢拔出，然后用同样的方法再注射另一侧，缝合皮肤，预防感染;完成AD动物模型建立，并构建大鼠视神经再生模型[9]。
　　1.3.2动物干预  空白对照组和模型对照组注入等体积的生理盐水，NSCs移植组植入NSCs细胞，细胞数量3×105/L;NCAM1基因修饰NSCs移植组注入NCAM1基因修饰NSCs的细胞（将NSC细胞以3×105/孔的密度铺至6孔板，AdNcam1以及AdGFP对照腺病毒分别以Mol=50的感染培养的NSCs），细胞数量3×105/L，各组均完成7 d干预。
　　1.4 观察指标  ①学习和记忆能力：各组干预后7 d进行Morris水迷宫实验，首先进行定位航行实验，将大鼠从不同的象限置入水池中，记录其游到水肿平台上的时间（潜伏期）;对于60 s内未达到平台，则将其引导到平台上并停留5 s，将潜伏期记录60 s，连续进行4 d实验;第5 s撤走水中平台，完成空间探索实验。固定入水点，记录60 s内在原平台象限内停留时间及大鼠经原平台位置的次数（穿环次数）[10];②组织学检测：各组干预后7 d每组取大鼠4只，以断颈方式处死，取各组视神经组织，石蜡包埋后常规制备4 μm切片，行HE染色，倒置显微镜下观察组织形态[11]。③海马CAI区神经元形态、NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA表达：各组干预后7 d每组取大鼠4只，以断颈方式处死，取各组海马CAI区神经组织，采用实时荧光PCR法测定各组NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA表达水平[12]。
　　1.5统计学方法  采用SPSS18.0软件处理数据，计数资料采用[n（%）]表示，行？字2检验;计量资料采用（x±s）表示，行t检验， P<0.05表示差异有统计学意义。 　　2结果
　　2.1四组学习和记忆能力比较  NCAM1基因修饰NSCs移植组潜伏期短于NSCs移植组和模型对照组，原平台象限内停留时间、穿环次数均多于NSCs移植组和模型对照组（P<0.05）;NSCs移植组潜伏期短于模型对照组，原平台象限内停留时间、穿环次数均多于模型对照组（P<0.05），见表1。
　　2.2四组HE染色比较  空白对照组未参与建模，视神经组织未见损伤;模型对照组建模后未给予有效处理，视神经损伤较为明显，伴有大量炎症细胞;NCAM1基因修饰NSCs移植组、NSCs移植组视神经损伤下对较轻，且NCAM1基因修饰NSCs移植组视神经损伤不明显，见图1。
　　2.3四组NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA比较  NCAM1基因修饰NSCs移植组NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于NSCs移植组和模型对照组（P<0.05）;NSCs移植组NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于模型对照组（P<0.05），见表2。
　　3讨论
　　阿尔茨海默病是一种发病相对隐匿的、进行性发展的神经系统性疾病，临床上以记忆障碍、视空间技能损害及执行功能障碍的为主，影响患者健康、生活。阿尔茨海默病病因复杂，其发病机制尚未完全常，主要具有神经细胞凋亡学说、内分泌失衡学说及神经细胞内钙超载学说等，而神经突触可塑性改变对阿尔茨海默病发生、发展的影响受到临床重视[13]。近年来，随着医疗技术的不断发展，NSCs移植被认为是其中最直接最有效的方法，该细胞从胚胎或成年哺乳动物脑内、脊髓中分离培养出来，能分化为神经元、少突胶质细胞，具备自我更新能力，能保证脑内细胞数。
　　在本研究中，NCAM1基因修饰NSCs移植组潜伏期短于NSCs移植组和模型对照组（P<0.05）;原平台象限内停留时间、穿环次数均多于NSCs移植组和模型对照组（P<0.05），说明NCAM1基因修饰NSCs移植能减轻AD大鼠视神经损伤，能延缓病情发展，有望成为AD新的靶点。NCAM1属于是一种细胞表明糖蛋白，为细胞粘附分子，且多数存在于神经系统中，能直接参与海马突触等神经生理功能。既往研究表明，NCAM1能调节海马突出的可塑性，能进行突触性与结构维护，在发育期即可表达，对海马神经的形态、功能发育具有重要的作用。临床研究表明，在突触塑形与维持突触结构方面，NCAM1能发挥良好的促进作用，其具有较强的粘附能力，能调节细胞相关功能。本研究中，HE染色结果表明：NCAM1基因修饰NSCs移植组、NSCs移植组视神经损伤下对较轻，且NCAM1基因修饰NSCs移植组视神经损伤不明显，说明NCAM基因修饰NSCs移植能减轻AD大鼠视神经损伤，可能与NCAM基因修饰后能增强NSCs干预作用，能发挥不同方法优势。为了进一步分析NCAM基因修饰NSCs移植在AD大鼠中的作用，本研究中通过实时荧光PCR技术对其相关基因进程测定，结果显示，NCAM1基因修饰NSCs移植组NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于NSCs移植组和模型对照组（P<0.05），进一步验证了NCAM基因修饰NSCs移植在AD大鼠中的作用，能改善AD大鼠视神经损伤。
　　综上所述，NCAM在成年大鼠视神经再生模型中呈低表达，经NCAM基因修饰NSCs移植用于成年大鼠视神经再生模型中能提高NCAM表达，有助于促进视神经再生。
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　　收稿日期：2020-02-12;修回日期：2020-02-21
　　編辑/成森
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