脑泰方对脑出血大鼠脑组织铁沉积致神经细胞过氧化损伤的影响

来源:用户上传      作者:曾劲松 喻坚柏 廖君 罗刚 唐宁 黄娟 李弘 葛金文

　　摘要：目的  觀察脑泰方对大鼠脑出血后脑组织铁沉积致神经细胞过氧化损伤的影响，探讨其作用机制。方法  采用自体血注射法构建SD大鼠脑出血模型，随机分为模型组、脑泰方组、阳性对照组、假手术组，各组均于给药7、14、28 d取材;HE染色观察脑组织病理变化，采用Zea Longa 5级评分法进行神经功能缺失评分，免疫组化检测病灶脑组织铁沉积量、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量，免疫荧光技术检测转铁蛋白（Tf）、转铁蛋白受体（TfR）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX-4）的表达。结果  与假手术组同一时点比较，模型组大鼠脑组织TfR和Tf表达上调，GPX-4表达下调，GSH含量下降，铁沉积量和MDA含量升高，神经功能缺失评分升高，差异均有统计学意义（P<0.01，P<0.05）;MDA含量与铁含量呈正相关，GSH含量及GPX-4水平与铁含量呈负相关，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，脑泰方组和阳性对照组大鼠脑组织TfR、Tf表达下调，GPX-4表达上调，GSH含量升高，铁沉积量、MDA含量降低，神经功能缺失评分降低，差异均有统计学意义（P<0.01，P<0.05）;与阳性对照组比较，脑泰方组对大鼠脑组织MDA、GSH含量调节作用更强，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  脑泰方可抑制模型大鼠脑组织铁输入蛋白的表达，减轻神经细胞铁超载，增强细胞抗氧化能力而发挥神经保护作用。
　　 关键词：脑泰方;脑出血;铁沉积;过氧化损伤;铁死亡;大鼠
　　 中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）04-0046-06
　　 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201908240
　　Effects of Naotai Formula on Peroxidative Injury of Nerve Cells Caused by Iron Deposition
　　in Brain Tissue of Rats after Intracerebral Hemorrhage
　　ZENG Jinsong1，2， YU Jianbai1， LIAO Jun2， LUO Gang1， TANG Ning1， HUANG Juan2， LI Hong2， GE Jinwen2
　　1. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China;
　　2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China
　　 Abstract： Objective To investigate the effects of Naotai Formula on peroxidation injury of nerve cells caused by iron deposition in brain tissue of rats after intracerebral hemorrhage; To discuss its mechanism of action. Methods Intracerebral hemorrhage model of SD rats was established by autologous blood injection. The rats were randomly divided into model group， Naotai Formula group， positive control group and sham-operation group. The samples were collected in three batches on 7， 14 and 28 d of administration. HE staining was used for histopathological observation; Zea Longa 5 grade scoring was used for neurological deficit; Immunohistochemical kit was used to detect iron content， malondialdehyde （MDA） content and glutathione （GSH） content in the brain tissue of the lesion; The expression levels of transferrin （Tf）， transferrin receptor （TfR）， glutathione peroxidase 4 （GPX-4） were detected by immunofluorescence technique. Results Compared with sham-operation group， expressions of TfR and Tf in brain tissues were up-regulated， GPX-4 expression was down-regulated， GSH content was down-regulated， iron deposition and MDA content increased， neurological deficit score increased in model group， with statistical significance （P<0.01， P<0.05）. MDA content was positively correlated with iron content， while GSH content and GPX-4 level were negatively correlated with iron content， with statistical significance （P<0.05）. Compared with model group， expressions of TfR and Tf in brain tissues were down-regulated， GPX-4 expression was up-regulated， GSH content was up-regulated， iron deposition and MDA content were down-regulated， HE staining pathological score and neurological deficit score were down-regulated in Naotai Formula group and positive control group， with statistical significance （P<0.01， P<0.05）. Compared with positive control group， Naotai Formula group had stronger regulation effect on contents of MDA and GSH， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Naotai Formula can inhibit the expression of iron-imported protein， reduce iron overload in nerve cells， enhance the antioxidant capacity of cells and then play a neuroprotective role. 　　 Keywords： Naotai Formula; intracerebral hemorrhage; iron deposition; peroxidation injury; ferroptosis; rats
　　 脑出血属中医学“中风”范畴，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。研究表明，脑出血后血肿中红细胞裂解释放的铁离子可导致继发性脑损伤，脑出血恢复期病灶脑组织中铁含量仍持续高于正常，且沉积的铁可被再次活化，造成继发性脑损伤[1]。研究表明，一种由铁超载诱发并以细胞抗氧化能力耗竭为特征的铁死亡是脑出血后神经元死亡的主要形式[2]。脑泰方是本研究团队葛金文教授防治中风的专利处方。课题组前期研究发现，该方可有效改善脑缺血大鼠神经元铁代谢而发挥脑保护作用[3-4]，这与铁死亡的核心机制相吻合。基于此，本研究采用自体血注射法构建SD大鼠脑出血模型，通过检测脑组织铁、脂质过氧化产物丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量及转铁蛋白（transferring，Tf）、转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX-4）的表达，脑组织病理学观察和神经功能缺失评分，探讨脑出血后铁沉积与细胞过氧化损伤的相关性，并以铁离子螯合剂去铁胺作为阳性对照药物，探讨脑泰方对脑出血大鼠脑组织铁沉积及其过氧化损伤的干预作用;以期对脑出血后继发性脑损伤的病理机制提出新的认识，同时为脑泰方治疗脑出血的科学性提供实验依据，丰富中医药治疗中风的现代生物学内涵。
　　1  材料与方法
　　1.1  动物
　　 健康成年SD大鼠，清洁级，体质量200～250 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于温度22～26 ℃，相对湿度40%～70%环境，通风换气8～10次/h，高温高压灭菌饲料及纯净水饮食，各组单笼喂养。
　　1.2  药物
　　 脑泰方（黄芪、川芎、地龙、僵蚕）4味中药按8∶2∶3∶3比例配方，饮片购自湖南中医药大学第一附属医院，经水煎等工艺制成浸膏粉，浸膏得率26.2%，每1 g浸膏粉相当于4 g原药材，含阿魏酸4.58 mg、川芎嗪2.20 mg、黄芪甲苷11.21 mg。临用时用生理盐水调配成2 g原药材/mL，以60 kg成年人每日剂量80 g原药材为依据，大鼠给药剂量按体表面积换算，2倍成人剂量为20 g/kg。去铁胺，瑞士诺华，500 mg/瓶，批号SL1830，大鼠按0.1 g/kg腹腔注射。
　　1.3  主要试剂与仪器
　　 水合氯醛（批号20180110），天津市科密欧化学试剂有限公司;多聚甲醛（批号20170113），国药集团化学试剂有限公司;PBS粉末（ZLI-9062），无锡傲锐东源生物科技有限公司;组织铁含量试剂盒（批号20190615），南京建成生物工程研究所;MDA试剂盒（批号20190611），南京建成生物工程研究所;GSH试剂盒（批号20190603），南京建成生物工程研究所。TfRⅠ抗（批号201901），规格50 mL/瓶，Bio-Swamp公司;TfⅠ抗（批号00025495）， 规格：0.1 mL/瓶，Proteintech公司;GPX-4Ⅰ抗（批号201901），规格：50 mL/瓶，Bio-Swamp公司。WP8025型脑立体定位仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），KDS310 Plus纳升级单通道微量注射泵（上海软隆科技发展有限公司），Enspire多功能酶标仪（美国Perkinelmer），BMJ-1n型病理组织包埋机（上海珂淮仪器有限公司），TS-12F型生物组织自动脱水机（上海华岩仪器设备有限公司），LKB-Ⅲ型超薄切片机（广州华俊科技有限公司），OLYMPUS倒置显微镜和照相装置（日本OLYMPUS），AUW120D型精密电子天平（日本Shimadzu），DW-HL-3985型美菱超低温冰箱[中科美菱（合肥）低温科技股份有限公司]，Z32HK台式高速冷冻离心机（杭州英斯特科技有限公司），KS400型图像分析仪（德国ZISSE）。
　　1.4  造模
　　 SD大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上，使前囟和后囟处于同一水平。备皮后常规消毒，沿前囟旁开3 mm作10 mm纵行切口，切开头皮及骨膜后暴露前囟，于前囟后方1 mm、旁开3 mm处用微型钻作直径1 mm小孔。消毒鼠尾后距末端0.5 cm处剪断，取自体血50 μL，经定位仪上微量注射器沿所钻骨孔进针6 mm，即为右侧尾状核的位置，10 min内注入自体血50 μL，注射完毕后停针5 min，缓慢退针，缝合切口。假手术模型制备步骤同上，不注入自体血，向大鼠尾状核注入生理盐水50 μL。
　　1.5  分组
　　 60只成模大鼠随机分为模型组、脑泰方组、阳性对照组和假手术组，每组15只。单笼喂养，自由摄食饮水。
　　1.6  给药
　　 脑泰方组大鼠造模后24 h按20 g/kg给予脑泰方灌胃，阳性对照组大鼠按0.1 g/kg予去铁胺腹腔注射，模型组和假手术组给予等量生理盐水腹腔注射。给药体积10 mL/kg，每日1次，连续28 d。
　　1.7  取材
　　 各组均于给药7、14、28 d预定时间点，参照随机数字表分别将其中5只大鼠作常规灌注固定后，断头取材。以注入针道为中心，冠状切下厚约5 mm标本，10%多聚甲醛固定，常规脱水，浸蜡，石蜡包埋，連续切片（厚度5 μm），备用。
　　1.8  指标检测
　　1.8.1  脑组织病理学检测
　　 取大鼠脑组织，4%多聚甲醛固定48 h，常规梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片，HE染色，脱水、透明、封片，光镜下观察脑组织病理改变。 　　1.8.2  神经功能缺失评分
　　 根据Zea Longa 5级评分法评定[5]。0分：无神经损伤症状;1分：不能完全伸展对侧前爪;2分：向对侧转圈;3分：向对侧倾倒;4分：不能自发行走，意识丧失。
　　1.8.3  脑组织铁、丙二醛、谷胱甘肽含量测定
　　 免疫组化试剂盒进行检测，严格按照试剂盒说明书步骤进行操作。
　　1.8.4  免疫荧光检测蛋白表达
　　使用相应Ⅰ抗兔抗鼠抗体，严格按试剂盒说明书操作。每份标本随机选取10个视野，用Image-proplus 6.0分析软件进行阳性目标视场平均灰度值、面积密度测定，并换算成阳性单位（PU），以PU值代表阳性产物表达水平。用阳性反应产物灰度级（Ga）、测试区域灰度级（GA）、面积（N）和背景面积（M）计算。PU=100×（Ga-GA）÷（1-N/M）×255。
　　1.9  统计学方法
　　 采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，方差齐性时用LSD检验，方差非齐性时用Dunnett’s T3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2  结果
　　2.1  大鼠神经功能缺失评分结果
　　 与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺失评分明显升高（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，脑泰方组和阳性对照组大鼠神经功能缺失评分明显降低（P<0.05）;第7、14日脑泰方组与阳性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），第28日脑泰方组大鼠神经功能缺失评分明显高于阳性对照组（P<0.05），提示脑泰方与去铁胺在脑出血早期均可改善大鼠脑损伤，但脑泰方远期效果优于去铁胺。见表1。
　　2.2  脑组织病理变化
　　HE染色结果显示，模型组大鼠血肿周围脑组织出现明显水肿、坏死，细胞排列不规则、疏松，细胞外间隙增大，呈网状结构，神经细胞变性坏死，大量炎性细胞浸润;与模型组比较，脑泰方组及阳性对照组大鼠脑组织肿胀减轻，神经元水肿变性减少，炎症细胞浸润减轻，固缩细胞较少，细胞周围间隙变小;假手术组脑组织无明显病理改变，神经细胞排列紧密整齐，神经细胞胞体大，胞核淡染、大且圆，见图1。
　　2.3  脑泰方对模型大鼠脑组织铁、丙二醛、谷胱甘肽含量的影响
　　 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织铁含量持续升高，于第14日达到高峰，第28日仍明显高于正常，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）;与假手术组比较，模型组大鼠脑组织MDA含量明显升高，GSH含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）;铁含量与MDA含量呈正相关（P<0.05），与GSH含量呈负相关（P<0.05）;与模型组比较，脑泰方组及阳性对照组大鼠脑组织铁及MDA含量明显降低，GSH含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）;与阳性对照组比较，脑泰方组对MDA、GSH含量调节作用更明显，阳性对照组对铁调节作用更明显（P<0.05）。见表2。
　　2.4  脑泰方对模型大鼠脑组织转铁蛋白、转铁蛋白受体、谷胱甘肽过氧化物酶4蛋白表达的影响
　　 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织Tf、TfR蛋白表达明显升高，GPX-4蛋白表达明显降低（P<0.01，P<0.05），Tf第7日达高峰，第28日基本恢复正常，TfR第14日达高峰，第28日仍高于正常（P<0.05）;与模型组比较，脑泰方组和阳性对照组大鼠脑组织Tf、TfR蛋白表达明显降低，脑泰方组GPX-4蛋白表达明显升高（P<0.01，P<0.05）;第7、14日脑泰方组Tf、TfR蛋白表达高于阳性对照组（P<0.05），第14、28日脑泰方组GPX-4蛋白表达明显高于阳性对照组（P<0.05）。见图2、表3。
　　3  讨论
　　 脑出血后伴随血肿溶解及红细胞破坏，脑组织间隙大量血红蛋白聚集，并进一步通过氧化反应产生活性氧（ROS）及含铁血红素;含铁血红素在血红素加氧酶作用下降解为铁离子、胆绿素及一氧化碳[6]。脑间质中铁离子与Tf结合后，再与神经细胞表面TfR结合进入细胞质，以铁蛋白的形式储存。由此可见，脑出血后在血肿周围脑间质中有大量铁聚集，脑间质中的铁主要经Tf/TfR途径向细胞内转运，从而出现细胞内铁沉积现象。研究表明，脑出血后第3日开始出现病灶周围脑组织铁沉积，在出血后第28日铁含量仍明显高于对侧正常脑组织[1]。另有研究者通过磁共振梯度回波成像跟踪检测脑出血患者脑铁沉积变化，并结合实验研究同步证实，脑出血后3个月病灶侧铁含量仍明显高于对侧脑组织[7]。本研究结果显示，脑出血模型大鼠脑组织铁含量持续升高，于第14日达到高峰，第28日时仍高于正常，这与上述研究结果一致。
　　 铁作为血肿降解的主要活性产物，主要通过氧化还原反应迅速增加ROS的浓度，造成神经细胞过氧化损伤[8]。这一生化过程与近年研究发现的铁死亡机制密切相关。铁死亡是一种由铁离子超载诱发，以脂质过氧化为特征的细胞死亡形式[9-10]。细胞内超载的铁离子通过Fenton反应产生大量ROS，使细胞内主要的抗氧化损伤体系中GSH耗竭，GPX-4活性被抑制，细胞有氧代谢产生的脂质氧化物不能经GSH/GPX-4途径清除，继而与细胞内超载的铁离子以类似Fenton反应的方式进一步产生大量脂质ROS，大量脂质ROS累积而使细胞发生铁死亡。研究表明，通过干预Tf及TfR蛋白表达，可调控细胞铁死亡[11]。GSH/GPX-4是细胞发挥抗氧化作用的核心体系，GPX-4是一种GSH依赖性酶，被证实是铁死亡的關键调控分子[12]。GSH、GPX-4及Tf、TfR为调控铁死亡的主要信号分子。本研究在检测脑组织铁沉积量的同时，同步检测GSH及脂质过氧化产物MDA的含量，分析铁沉积与铁死亡的相关性，结果显示，铁沉积量与GSH呈负相关，与MDA呈正相关，提示铁沉积是脑出血后铁死亡发生的主要原因。 　　 近年來，一些中药复方或单体被证实可调节铁代谢而发挥神经保护作用，如黄芪多糖可减轻间充质干细胞铁超载所致神经功能障碍[13];淫羊藿、黄芪、葛根提取物均可减轻神经细胞铁超载[14];黄芩素可减轻铁沉积和脂质过氧化而抑制细胞铁死亡[15]。脑泰方是本团队多年应用于临床治疗脑卒中的经验方，课题组对其进行了多项临床及实验研究。方中黄芪大补脾胃之气为君药，令气旺血活，血活则瘀除，其有效成分为黄芪甲苷;川芎活血行气，气行则血行，是为臣药，其活性成分为川芎嗪、阿魏酸;地龙、僵蚕通经活络、化痰熄风，均为佐药，有效成分为地龙肽、促蜕皮甾醇等。诸药合用共奏益气活血通络、祛风化痰之效，切合脑出血以虚、瘀为主的中医病机。本研究基于前期脑泰方调节铁代谢而发挥神经保护作用的研究基础，以铁离子螯合剂去铁胺作为阳性对照药物，通过检测Tf、TfR及GPX-4的表达水平，探讨脑泰方对脑出血大鼠脑组织铁沉积及其过氧化损伤的干预作用;结果显示，脑泰方可明显下调TfR、Tf水平，上调GPX-4水平，促进GSH合成，降低铁和MDA含量。减轻脑组织病理损伤及神经功能缺失;其在调节铁代谢方面，起效时间和强度弱于去铁胺，但对GSH及GPX-4调节作用优于去铁胺，第28日组织病理学改变及神经功能缺失评分优于去铁胺。这与前期脑出血后去铁胺神经保护作用研究结果[16-17]一致。
　　 从脑泰方与去铁胺的效果差异推测，脑泰方还有可能通过其他途径提高GSH、GPX-4水平，从而提高细胞的抗氧化能力，如调节胱氨酸/谷氨酸逆向转运体的活性影响谷氨酸代谢亦为铁死亡的调节途径之一，前期研究表明，脑泰方可降低脑组织内兴奋性氨基酸毒性，提高细胞抗氧化能力[18]，今后我们将以此为靶向开展进一步研究。
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　　（收稿日期：2019-08-16）
　　（修回日期：2019-10-04;编辑：华强）
　　基金项目：国家自然科学基金（81774174、81774033）;湖南省中医药科研项目（201969）;湖南中医药大学中西医结合一流学科开放基金（2018ZXYJH15）
　　通讯作者：葛金文，E-mail：40831556@qq.com
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