吡拉格雷钠对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能的改善作用及机制研究

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　　摘 要 目的：研究吡拉格雷鈉对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能的改善作用及相关机制。方法：将72只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组（地佐环平 0.8 mg/kg）和吡拉格雷钠低、中、高剂量组（20、30、45 mg/kg），每组12只。除假手术组大鼠行假手术外，其余各组大鼠均采用大脑中动脉结扎诱导脑缺血再灌注损伤模型。术后2 h尾静脉注射相应药物，假手术组和模型组大鼠注射等量生理盐水，连续给药6 d，给药间隔均为24 h。再灌注24 h和末次给药后，评估大鼠的神经功能缺陷评分和姿势反射评分，采用微正电子发射断层扫描评估脑损伤情况（包括全脑、岛状皮层﹑壳核﹑纹状体﹑体细胞皮层﹑杏仁核、运动皮层）。然后处死大鼠，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色后观察脑梗死情况并计算脑梗死体积，酶联免疫吸附试验检测其脑组织中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和谷氨酸（Glu）含量。结果：与假手术组比较，模型组大鼠缺血再灌注后24 h和末次给药后的神经功能缺陷评分、姿势反射评分均明显升高（P<0.05或P<0.01），脑缺血再灌注24 h与末次给药后脑组织的SUV、全脑及各不同脑区的右左脑SUV比值均明显降低（P<0.01）；末次给药后脑梗死体积百分数明显升高（P<0.01），脑组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明显降低（P<0.01），Glu含量明显升高（P<0.01）。与模型组比较，吡拉格雷钠低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠上述指标均明显改善（P<0.05或P<0.01）。结论：吡拉格雷钠对大鼠脑缺血再灌注损伤和神经功能有改善作用，这可能与上调脑组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性和下调Glu含量有关。
　　关键词 吡拉格雷钠；脑缺血再灌注损伤；神经功能；大鼠；机制
　　Improvement Effects and Mechanism Study of Pyragrel Sodium on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats
　　SUN Xiang，LI Qinglin（Research Laboratory Center， Anhui University of TCM/Key Lab of Xin’an Medical Medicine， Ministry of Education， Hefei 230038， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effect and related mechanism of pyragrel sodium on nerve function of cerebral ischemia-reperfusion injury model rats. METHODS： Totally 72 SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， positive control group （dizocilpine 0.8 mg/kg）， pyragrel sodium low-dose， medium-dose and high-dose groups （20， 30， 45 mg/kg）， with 12 rats in each group. Except sham operation group received sham operation， rats in the other groups were treated with middle cerebral artery ligation to induce cerebral ischemia-reperfusion injury model. The rats in the sham operation group and the model group were injected with the constant volume of normal saline， for consecutive 6 d， and the interval of administration was 24 hours. After 24 h reperfusion and last medication， neurological deficit score and postural reflex score in rats were evaluated. The situation of cerebral injury （including whole brain， insular cortex， putamen， striatum， somatic cortex， amygdala， motor cortex） was evaluated by using micropositron emission tomography. The rats were sacrificed， and the situation of cerebral infarction was observed by TTC and cerebral infarction volume was calculated. Na+-K+-ATPase， Ca2+-ATPase activity and Glu content were detected by ELISA. RESULTS： Compared with sham operation group， neurological deficit score and postural reflex score increased significantly in model group 24 h after ischemia-reperfusion and after last medication （P<0.05 or P<0.01）. After 24 hours of cerebral ischemia-reperfusion and the last medication， SUV of brain tissue， SUV ratio of right left brain of different cerebral areas were decreased significantly （P<0.01）. After last medication， the percentage of cerebral infarction volume was increased significantly （P<0.01）； the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were decreased significantly （P<0.01）， while Glu content was increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， above indexes of pyragrel sodium low-dose， medium-dose and high-dose group， positive control group were all improved significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Pyragrel sodium can improve cerebral ischemia-reperfusion injury and nerve function， which is related to the activity up-regulation of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase， the down-regulation of Glu content. 　　KEYWORDS Pyragrel sodium； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Nerve function； Rats； Mechanism
　　脑卒中是一种急性脑血管疾病，是脑血管破裂或血管阻塞导致血液无法流入大脑引起的脑部损伤。在脑卒中的两个主要亚型中，缺血性脑卒中的发生率高于出血性脑卒中[1]。缺血性脑卒中具有发病率高、病死率高、致残率高的特点，已经是成年人致残的主要原因之一。尤其是脑卒中缺血后的再灌注损伤，是导致脑部损伤的主要原因，其中神经损伤最为严重。目前，缺血性脑卒中的治疗主要包括手术治疗和药物治疗，药物治疗又分为溶栓治疗、抗血小板治疗、早期抗凝治疗和应用神经保护剂等[2]，其中，应用神经保护剂是急性缺血性脑卒中特异性治疗的主要方法。
　　吡拉格雷钠（Pyragrel sodium）是一种以中药活性成分川芎嗪和阿魏酸为基本骨架设计合成的新型化合物[3]。前期研究表明，吡拉格雷钠可以扩张血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、增强组织抗氧化作用，并具有显著的抗脑缺血作用，此外，吡拉格雷钠还具有促进微循环血流、改善内皮损伤和神经功能的作用[4-5]。但是吡拉格雷钠对于脑缺血再灌注损伤和神经功能是否也有保护作用尚不清楚。为了给临床试验提供参考，本研究通过神经学评分、微正电子發射断层扫描（Micro-PET）和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色评估吡拉格雷钠对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能的改善作用，以证实吡拉格雷钠的神经保护作用。同时，对吡拉格雷钠的神经保护机制进行初步探索。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　HH-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；FSH- 2A可调高速匀浆机（金坛市大盛实验仪器有限公司）；80-2台式低速离心机[上海医疗器械（基团）有限公司手术器械厂]；JA3003 电子天平（上海精科天平仪器厂）；Infinite M 200 PRO全波长酶标仪（瑞士Tecan公司）；AtomlabTM 500活度计（美国Biodex公司）；Inveon Micro-PET仪（美国西门子公司）；VIP 3000麻醉机（美国Matrx公司）。
　　1.2 药品与试剂
　　吡拉格雷钠原料药（合肥医工医药有限公司，批号：20170616，纯度：99.3%）；地佐环平原料药（批号：080M4610V，纯度：99.5%）、TTC均购自美国Sigma公司；生理盐水（山东科瑞药业有限公司，批号：20170125）；PET扫描显像剂氟化脱氧葡萄糖（18F-FDG）[米度（南京）生物技术有限公司]；谷氨酸（Glu）检测试剂盒、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（上海宝曼生物科技有限公司）。
　　1.3 动物
　　SPF级SD大鼠72只，♂，8周龄，体质量200～250 g，购自浙江省实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2017-0001。
　　2 方法
　　2.1 缺血再灌注损伤模型的复制
　　采用大脑中动脉结扎复制大鼠脑缺血再灌注损伤模型[6]。通过腹膜注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，暴露左颈总动脉（CCA）和颈外动脉（ECA），然后将尼龙缝合线从CCA插入颈内动脉（ICA）并向前移动，以封闭左大脑中动脉（MCA）的根部直至出现轻微阻力。在缺血2 h后，除去尼龙缝合线以恢复血流（再灌注）持续24 h。假手术组大鼠接受相同的手术，但未插入尼龙缝合线。在整个过程中保持大鼠体温在（37.0±0.5） ℃。
　　2.2 分组
　　将大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组和吡拉格雷钠低、中、高剂量组，每组12只，其中6只用于脑组织TTC染色进行脑梗死体积检测，剩余6只用于检测脑组织匀浆中Glu含量和ATP酶活性。
　　2.3 给药方法
　　吡拉格雷钠低、中、高剂量组大鼠按“2.1”项下方法复制脑缺血再灌注损伤模型后尾静脉注射吡拉格雷钠，给药剂量依据前期实验研究结果设定为20、30、45 mg/kg，每日1次；阳性对照组大鼠按“2.1”项下方法复制脑缺血再灌注损伤模型后尾静脉注射地佐环平，给药剂量为0.8 mg/kg[7]，每日1次；模型组大鼠按“2.1”项下方法复制脑缺血再灌注损伤模型后每日注射1次生理盐水；假手术组大鼠行假手术后每日尾静脉注射1次生理盐水。首次给药时间均为缺血后2 h，连续用药6 d，给药间隔均为24 h。
　　2.4 神经学评分
　　缺血再灌注后24 h和末次给药后，使用改良的Longa五点量表评分系统[6]分别对各组大鼠进行神经功能缺陷评分和姿势反射评分。神经功能缺陷评分标准：无神经缺陷为0分；左肢体不能完全伸展为1分；行走时向右侧转圈为2分；行走时向右侧倾倒为3分；不能自发行走为4分；死亡为5分。姿势反射评分标准：两前肢完全伸展为0分（正常）；左前肢贴在胸部，右前肢伸展为1分（轻度异常）；左前肢贴在胸前，上半身卷曲为2分（严重异常）。
　　2.5 脑损伤扫描
　　通过Micro-PET确定各组大鼠脑摄取18F-FDG的情况评价脑损伤情况。缺血再灌注后24 h和末次给药后，分别对所有大鼠进行Micro-PET，在Micro-PET之前，大鼠禁食12 h以增强脑18F-FDG摄取，然后尾静脉注射18F-FDG（1.5 mCi/kg），1 h后将大鼠固定在扫描床上，进行扫描，扫描时间10 min，记录整个大脑的扫描图及整个大脑和不同脑区（岛状皮层﹑壳核﹑纹状体﹑体细胞皮层﹑杏仁核、运动皮层）的标准化摄取值（SUV）。SUV值越低，脑损伤越严重。计算右左脑SUV比值=右侧分区SUV/左侧分区SUV。
　　2.6 脑梗死体积的测量 　　Micro-PET扫描后，麻醉下处死大鼠，每组取6只大鼠的脑组织切成2.0 mm切片并浸入2%TTC中30 min，然后在4%多聚甲醛中于4 ℃下固定过夜，然后使用Image-Pro Plus 6.0软件计算脑梗死体积，取平均值。正常脑组织呈红色，梗死组织呈浅灰色。
　　2.7 脑组织中Glu含量和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的检测
　　将每组剩余的6只大鼠，在冰浴中取下全脑，制备成10%的组织匀浆，按试剂盒操作，检测脑组织中Na+-K+- ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和Glu含量。
　　2.8 统计学方法
　　使用SPSS 17.0软件进行统计分析。通过单因素方差分析分析多组之间的差异，t检验评估两组之间的差异。P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　3 结果
　　3.1 神经功能缺陷评分和姿势反射评分
　　假手术组大鼠神经功能缺陷评分和姿势反射评分均为0，模型组大鼠神经功能缺陷评分和姿势反射评分明显高于假手术组（P<0.01）。与模型组比较，吡拉格雷钠低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠缺血再灌注后24 h和末次给药后的神经功能缺陷评分、姿势反射评分均明显降低（P<0.05或P<0.01）。说明吡拉格雷钠可以显著改善缺血再灌注的神经功能，且具有剂量依赖性。5组大鼠不同时间点的神经功能缺陷评分、姿势反射评分结果见图1。
　　3.2 Micro-PET扫描
　　3.2.1 各组大鼠脑部SUV比较 假手术组大鼠呈现出完整的脑区，未观察到脑缺血损伤；其余各组大鼠缺血再灌注后24 h均呈现出脑缺血损伤。与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血再灌注后24 h与末次给药后脑组织的SUV明显降低。与模型组比较，吡拉格雷钠低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠脑缺血再灌注24 h与末次给药后脑组织的SUV明显增加。各组大鼠脑组织的Micro-PET扫描图见图2。
　　3.2.2 各组大鼠右左脑SUV比值 假手术组大鼠呈现出完整的脑区，右左脑SUV比值为“1”。与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血再灌注后24 h与末次给药后右左脑SUV比值明显降低（P<0.01）。与模型组比较，吡拉格雷钠低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠脑缺血再灌注后24 h右左脑SUV比值明显升高（P<0.01），吡拉格雷钠低、中剂量组和阳性对照组大鼠末次给药后右左脑SUV比值明显升高（P<0.01），更接近“1”，说明吡拉格雷钠具有改善脑缺血再灌注损伤的作用。各组大鼠的右左脑SUV比值结果见图3。
　　3.2.3 不同脑区右左脑SUV比值 与假手术组比较，模型组大鼠的岛状皮层﹑壳核﹑纹状体﹑体细胞皮层﹑杏仁核、运动皮层脑区的右左脑SUV比值明显降低（P<0.01）。与模型组比较，吡拉格雷钠低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠的岛状皮层﹑壳核﹑纹状体﹑体细胞皮层、杏仁核、运动皮层脑区的右左脑SUV比值明显升高（P<0.05或P<0.01），更接近“1”。各组大鼠不同脑区右左脑SUV比值测定结果见图4。
　　3.3 脑梗死体积
　　与假手术组比较，模型组大鼠的脑梗死体积明显增加（P<0.01）。与模型组比较，吡拉格雷钠低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠的脑梗死体积明显减小（P<0.05或P<0.01），且与吡拉格雷钠呈现剂量依赖性。各组大鼠的脑梗死体积图片见图5，测定结果见表1。
　　3.4 Na+-K+-ATP酶活性
　　与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明显降低（P<0.01）。与模型组比较，吡拉格雷钠低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠脑组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。表明吡拉格雷鈉可以增强缺血再灌注后脑组织中ATP酶活性。各组大鼠脑组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性测定结果见图6。
　　3.5 Glu含量
　　与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中Glu含量明显升高（P<0.01），说明脑缺血再灌注后脑组织Glu水平上升。与模型组比较，吡拉格雷钠低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠脑组织中Glu含量均明显降低（P<0.01），说明吡拉格雷钠可能会降低脑缺血再灌注后Glu诱导的兴奋性毒性。 各组大鼠脑组织中Glu含量的测定结果见图7。
　　4 讨论
　　由脑动脉闭塞诱导的缺血性中风会显著降低局部脑血流量，并诱导细胞死亡，使脑萎缩和功能缺陷[8-9]。缺血性脑组织中局部血液灌注的恢复在组织修复和功能恢复中起关键作用[10]。地佐环平可以特异性地拮抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体并降低Glu的毒性，是实验中常用的神经保护剂，因此本研究以其为阳性对照药[7]。ATP酶活性与Glu转运蛋白活性密切相关，而谷氨酸转运蛋白对于维持突触间隙中Glu浓度的稳定性非常重要。
　　在脑缺血再灌注的药物研究中，神经功能评分是一个重要指标[11-12]，其与后期生存率密切相关。吡拉格雷钠低、中、高剂量组的神经功能评分和姿势反射评分显著低于模型组。表明吡拉格雷钠可以改善脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经功能。此外，吡拉格雷钠减少了模型大鼠的脑梗死体积。
　　Micro-PET是一种成像技术，可以对大脑中的各种分子水平进行无创的体内测量。18F-PDG是Micro-PET成像中最常用的正电子成像剂。作为葡萄糖类似物，18F-PDG与葡萄糖竞争性地结合细胞膜上的葡糖转运蛋白（GLUT）并进入细胞。然后，18F-FDG在己糖激酶的作用下产生6-磷酸-18F-FDG。6-磷酸-18F-FDG不能进入细胞中参与糖酵解而停留在体内[13]。因此，18F-FDG可以反映组织吸收葡萄糖和葡萄糖代谢活动的能力，此外，18F-FDG的摄取也与组织血液供应密切相关，正常情况下，大脑右左脑区对18F-FDG的摄取值SUV值比率为1[14]。Micro-PET图像显示，假手术组在24 h均呈现出完整的脑区，未观察到脑缺血再灌注；从24 h图像可观察到各手术组SD大鼠呈现出脑缺血再灌注，主要出现在壳核、杏仁核、纹状体、听觉皮层、内嗅皮层、顶叶、躯体感觉皮层、下丘脑、嗅觉球等脑区分区，缺血再灌注后各手术组上述左右脑区分区的SUV比率降低；小脑灰质、小脑白质区域SUV比值基本无化，提示该部位无脑缺血再灌注；吡拉格雷钠和阳性药物可不同程度地改善大鼠脑缺血再灌注损伤。 　　作为主要的兴奋性神经递质之一，Glu在大脑的正常生理状态中起重要作用。然而，在脑缺血再灌注和其他病理状况中，大脑中大量Glu释放可引起兴奋性毒性并成为缺血性神经元损伤的主要诱发因素。Glu的兴奋毒性主要由与神经细胞膜受体的结合引起，并导致细胞内Na+和Ca2+的增加[15]。细胞内Ca2+浓度的增加可诱导线粒体功能异常、蛋白酶活化、活性氧（ROS）的产生和NO的释放，从而导致神经元死亡。细胞内Na+的增加可导致过量的水进入细胞，从而导致神经毒性水肿和细胞死亡。一方面，当缺血和缺氧发生时，细胞内ATP产生减少会导致ATP酶功能障碍，进而影响Glu转运蛋白的转运，进而导致Glu过量。Glu在突触间隙中的积累和Glu受体的激活，最终导致兴奋性毒性。另一方面，大量的Glu将与神经元细胞膜受体结合并抑制Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。进而导致Na+和Ca2+内流并进一步引发神经元细胞死亡的级联[16]。吡拉格雷钠可通过增加ATP酶活性，增强Glu转运蛋白的转运能力，然后去除突触间隙中Glu的积累来降低兴奋性毒性，从而保护神经系统。
　　总之，吡拉格雷钠能显著改善神经功能缺损评分、降低术后脑梗死体积、改善脑缺血再灌注后脑部葡萄糖的摄取量、改善脑部血流，还能增强缺血再灌注脑组织中的ATP酶活性、降低Glu含量。提示吡拉格雷钠对脑缺血再灌注损伤和神经功能均有保护作用，这可能与ATP酶-Glu转运蛋白-Glu信号通路有关。
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　　（收稿日期：2018-12-11 修回日期：2019-02-18）
　　（编辑：邹丽娟）
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