叶酸促糖尿病肾病大鼠足微循环改善机制研究
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【摘要】目的：探讨叶酸对糖尿病肾病大鼠足微循环的改善机制。方法：将25只健康雄性SD大鼠适应性喂养1周后随机分为2组，分别为正常组（5只）和造模组（20只）。给模型组大鼠每天喂高脂高糖日粮，正常组喂基础日粮。4周后称量体重，造模大鼠空腹腹腔注射1%的链脲佐菌素溶液（sTZ，30mg/kg），正常组注射相等容量的柠檬酸盐缓冲液。喂养2周后，测定正常组与模型组的血糖和胰岛素水平。用基础饲料统一喂养造模后的大鼠和正常组大鼠。模型大鼠随机分为s证组、和低剂量（1.5mg/kg）、中剂量（3mg/kg）、高剂量（5mg/kg）叶酸组进行干预，再检测大鼠鼠尾血糖浓度。各组均在干预灌胃3d后心脏无菌取血制备血清。在底面积75 cm2的培养瓶中加入完全培养基进行小鼠足细胞培养。将正常组和模型组小鼠足细胞的培养依次分为空白对照组、stz组、正常鼠血清对照组和添加低、中、高剂量叶酸血清组。刺激24h之后用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清VEGF水平，后通过PCR技术检测mRNA中VEGF水平，后用蛋白质印迹法（wB）检测蛋白质VEGF表达水平。结果：在高糖组和正常鼠血清组小鼠足细胞观察到VEGF的阳性表达。添加叶酸的血清组足细胞VEGF在蛋白质和mRNA中的表达比高糖组和正常鼠血清组有所降低，差异具有统计学意义。结论：叶酸能够介导血管内皮因子（VEGF）水平从而改善糖尿病肾病大鼠足的微循环。
【关键词】叶酸 糖尿病肾病 足细胞 血管生长内皮因子
糖尿病肾病（DN）是目前糖尿病病人最重要的并发症之一。在中国，糖尿病肾病的发病率呈现出明显的上升趋势。其中糖尿病肾病的发生机制中就有众多细胞因子的活化，其中就包括血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素（Ang）等。研究人员在对糖尿病患者的长期观察中发现血管内皮生长因子（VEGF）的浓度较非糖尿病患者显著升高。已有研究表明补充叶酸能有效降低糖尿病肾病的发病率，但补充叶酸对降低糖尿病肾病的发病率的理论机制并不十分清楚。本研究假设通过补充叶酸能够介导血管内皮因子（VEGF）水平从而改善糖尿病肾病大鼠足的微循环。现报告如下：
一、材料
（1）动物。健康雄性sD大鼠25只，体重200～220g。
（2）药物。叶酸片购于天津力生叶酸片。分别配置低（1.5mg/kg）、中（3mg/kg）、高剂量（5mg/kg）叶酸。
二、实验方法
（一）分组与细胞培养
将25只健康雄性sD大鼠基础喂养1周后随机分为2组，分别为正常组（5只）和造模组（20只）。模型组大鼠喂每日喂养高脂高糖饲料（基础饲料加20%的猪油、15%的蔗糖、5%的奶粉），正常组喂以基础饲料。4周后，称量体重。造模大鼠空腹腹腔注射1%的链脲佐菌素溶液（sTz，30mg/kg），正常组注射相同体积的柠檬酸盐缓冲液。喂养2周后，在正常组和模型组中测量血糖和胰岛素水平。模型组大鼠和正常组大鼠继续喂食基础饲料。将成模大鼠随机分为正常对照组、1%链脲佐菌素溶液组（30mg/kg）和低（1.5mg/kg）、中（3mg/kg）、高剂量（5mg/kg）叶酸并注射1%链脲佐菌素溶液组（30mg/kg）组进行干预，干预后检测大鼠鼠尾血糖浓度。在灌胃3天后心脏无菌取血制备血清。小鼠足细胞培养：将完全培养基加入到底面积为75cm2的培养瓶中进行培养。将正常组和模型组小鼠足细胞培养分为空白对照组（Nc）、stz高糖组（HG）、正常鼠血清对照组（NR）、和加入低剂量（LJ）、中剂量（N1））、高剂量（H1））叶酸血清组。
（二）指标检测
（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）计算确定实验所需的板条数量，并将其取出后再放置于框架中。设置空白孔并仅添加TMB显色液和终止液在空白孔中。对每次实验进行标准测试，并绘制出标准曲线。将不同浓度标准品加入到相应孔中，并在室温下温育120分钟。将板洗涤5次并加入生物素化的抗体工作溶液。在室温下孵育60分钟。将板洗涤5次，加入酶结合物工作溶液，在室温下进行避光孵育20分钟。将板洗涤5次，再加入显色剂TMB100ul/孔，黑暗中温室孵育20分钟，加入50u1/孔的终止液，混合均匀后立刻测量0D450的值。
（2）荧光实时定量PCR技术用于检测mRNA中VEGF水平。
（3）免疫印迹法蛋白质印迹法（Western Blot）分析蛋白质中VEGF的表达水平
（三）统计学方法
使用SPSS17.0软件进行数据分析。测量数据中计量资料表示为均数±标准差，统计方法使用单因素方差分析和LSD检验。
三、结果
（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）测大鼠血清VEGF水平
正常组和高糖组的细胞浆与核周均可见VEGF阳性表达且表达量接近。然而，添加了低、中、高剂量的叶酸组中VEGF的表达较低。
（二）荧光实时定量PCR检测mRNA中VEGF水平
添加叶酸组mRNA中VEGF表达水平较高糖组和正常鼠血清組明显降低。（p<0.05）叶酸剂量与VEGF表达水平呈负相关。
（三）蛋白质印迹法（Western Blot）检测蛋白质VEGF表达水平
由表1结果可知与正常大鼠血清组相比高糖组中VEGF的表达情况明显升高。添加不同剂量叶酸后各组大鼠VEGFmRNA表达量均有所降低。差异具有统计学意义。（P<0.05）
四、讨论
VEGF（血管内皮生长因子）是促进血管新生的促血管生成因子。研究表明慢性高血糖症能刺激VEGF合成和分泌，并引发一系列代谢和血液动力学效应，导致VEGF增加，并导致DM微血管并发症。叶酸是一种水溶性维生素，在基因调控所需的甲基化过程中起着甲基供体的作用。Sonny Bherwani等人通过测量糖尿病肾病患者血清叶酸与尿微量白蛋白比值发现叶酸水平的下降与糖尿病肾病有关。叶酸的显著降低使糖尿病肾病的机会增加19.9%。
本实验结果显示，糖尿病肾病小鼠的足细胞VEGF表达较对照小鼠高，显示其在DN微血管病变中的意义重大。我们在饲料中添加不同剂量的叶酸，结果显示添加叶酸的血清组小鼠足细胞VEGF在蛋白质和mRNA中的表达均较高糖组和正常鼠血清组降低，由此说明补充叶酸能够介导血管内皮因子（VEGF）水平改善糖尿病肾病大鼠足的微循环。为降低糖尿病患者的发病率和死亡率提供了新的科学参考依据。
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