电针联合两色金鸡菊提取物对糖尿病肾病大鼠肾脏Vimentin、α-SMA、TGF-β1及p-smad2表达的影响

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　　 摘要：目的  观察电针联合两色金鸡菊提取物对糖尿病大鼠肾脏波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β1（TGF-β1）及p-smad2表达的影响，探讨其作用机制。方法  将36只SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针组、两色金鸡菊组、电针+两色金鸡菊组和二甲双胍组，每组6只。采用高糖高脂喂养联合腹腔注射链脲佐菌素建立2型糖尿病模型。正常组、模型组不进行干预;电针组针刺大鼠双侧“肾俞”“脾俞”，连接电针，留针30 min;两色金鸡菊组予两色金鸡菊乙酸乙酯提取物（300 mg/kg）灌胃;电针+两色金鸡菊组予电针联合两色金鸡菊乙酸乙酯提取物灌胃;二甲双胍组予二甲双胍（200 mg/kg）药液灌胃。每日1次，治疗4周。HE染色观察肾组织形态学及纤维化程度，Western blot检测肾组织Vimentin、α-SMA、TGF-β1及p-smad2蛋白表達。结果  HE染色结果显示，电针组、两色金鸡菊组、电针+两色金鸡菊组和二甲双胍组均可缓解模型大鼠肾小管扩张，减轻肾小球皱缩现象，改善炎性细胞浸润，减少基底膜增生和融合，且以电针+两色金鸡菊组改善更明显;Western blot检测结果显示，电针和两色金鸡菊提取物均可降低模型大鼠肾组织Vimentin、α-SMA、TGF-β1及p-smad2蛋白表达，且以两者联合效果最佳。结论  电针联合两色金鸡菊提取物可明显改善糖尿病大鼠肾脏纤维化，其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad2信号通路有关。
　　 关键词：电针;两色金鸡菊提取物;糖尿病肾病;波形蛋白;α-平滑肌肌动蛋白;转化生长因子-β1;Smad2;大鼠
　　 中图分类号：R245;285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）06-0055-04
　　Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture combined with coreopsis tinctoria extract for expressions of Vimentin， α-SMA， TGF-β1 and p-smad2 in renal tissue of diabetic rats; To discuss its mechanism of action. Methods Totally thirty-six SD rats were randomly divided into normal group， model group， electroacupuncture group， coreopsis tinctoria group， electroacupuncture combined with coreopsis tinctoria group and metformin group， with 6 rats in each group. Type 2 DM model was established by high-fat and high-glucose diet and STZ injection intraperitoneally. Normal group and model group were given no treatment; Electroacupuncture was at the acupoints of “Pishu” and “Shenshu” once daily in electroacupuncture group for 30 min; coreopsis tinctoria group was given intragastric administration of 300 mg/kg coreopsis tinctoria extract for gavage; electroacupuncture combined with coreopsis tinctoria group was given electroacupuncture and intragastric administration of coreopsis tinctoria extract for gavage; metformin group was given intragastric administration of 200 mg/kg metformin for gavage. Histological changes and fibrosis degree of kidneys were observed by HE staining and expressions of Vimentin， α-SMA， TGF-β1 and p-smad2 were detected by Western blot. Results HE staining results indicated that
　　 糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）已成为终末期肾病的第2位致病因素[1]。终末期肾病一旦形成，治疗极为棘手。因此，及时治疗DN，防止其向终末期肾病转化意义重大。肾脏纤维化是DN主要的病理特征之一，前期研究发现，两色金鸡菊提取物对高糖高脂诱导的大鼠肾小球系膜纤维化有明显抑制作用[2-3]，而电针也可改善DN肾功能和超微结构[4]。本实验拟将电针联合两色金鸡菊提取物干预DN大鼠，观察其对DN大鼠肾脏波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β1（TGF-β1）及p-smad2表达的影响，明确两者是否存在协同作用，为临床治疗DN提供依据。
　　1  材料与方法 　　1.1  动物及分组
　　 SPF级雄性SD大鼠36只，体质量（250±5）g，新疆医科大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（新）2011-0004。饲养于温度（21±2）℃、相对湿度40%～50%环境，明暗周期12 h，自由摄食饮水，适应性饲养7 d。
　　1.2  药物
　　 两色金鸡菊乙酸乙酯提取物冻干粉，乌鲁木齐三高和药业有限公司，批号20170308;盐酸二甲双胍片，中美上海施贵宝制药有限公司，批号 20150109。
　　1.3  主要试剂与仪器
　　 链脲佐菌素（Sigma公司），Vimentin、TGF-β1、Smad2及GAPDH抗体（Abcam公司），α-SMA抗体（美国CST公司）。G6805-1电针治疗仪（青岛鑫升实业有限公司），BX43显微镜（日本OLYMPUS公司），华佗牌0.30 mm×13mm一次性针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）。
　　1.4  分组和造模
　　 采用随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、电针组、两色金鸡菊组、电针+两色金鸡菊组和二甲双胍组，每组6只。参考前期造模方法[5]，实验大鼠高糖高脂饲料喂养3个月，腹腔注射1%链脲佐菌素（35 mg/kg），1周后检测，随机血糖>11.1 mmol/L视为造模成功。
　　1.5  干预
　　 正常组普通饲料喂养;其余各组造模后继续高糖高脂饲料喂养;电针组造模后即刻予针刺双侧“脾俞”“肾俞”，穴位选择参照《实验针灸学》[6]常用实验动物穴位图谱取穴，“肾俞”位于第2腰椎旁开7 mm、“脾俞”位于12胸椎棘突下旁开7 mm，一次性针灸针直刺进针后连接电针仪，频率2/10 Hz疏密波，电流1 mA，持续30 min;两色金鸡菊组予两色金鸡菊乙酸乙酯提取物（300 mg/kg，10 mL）灌胃;电针+色金鸡菊组予电针联合两色金鸡菊乙酸乙酯提取物灌胃;二甲双胍组给予盐酸二甲双胍（200 mg/kg，10 mL）药液灌胃。每日1次，连续4周。
　　1.6  取材
　　 干预4周后同步取材，戊巴比妥腹腔注射麻醉，切取双肾，左肾置于4%甲醛中固定，用于HE染色;右肾置于液氮中固定，进行总蛋白提取及Western blot检测。
　　1.7  HE染色
　　 4%甲醛中固定48 h后，石蜡包埋，切片（厚度约4 μm），常规梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）脱水，二甲苯脱蜡，经各级乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）至水洗。苏木素染色5 min，自来水冲洗;盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，置伊红液2 min，脱水、透明，树胶加盖玻片封固。HE染色，光镜下（×400）观察并拍照。
　　1.8  Western blot检测
　　 各组随机取等量肾组织（100 mg）放入1.5 mL EP管中，加入1 mL预冷的组织蛋白裂解液，匀浆机研磨均匀，置于冰上裂解20 min，4 ℃、14 000×g离心10 min，取上清液，BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。取裂解蛋白50 μg，80 V电泳至浓缩胶与分离胶分界线处，然后换为100 V电泳70 min，肉眼观察溴酚蓝的条带距胶底约1 cm停止电泳，换100 V电转70 min，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗（Vimentin、α?SMA、Smad2、GAPDH抗体，1∶1000）4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，洗膜后加入显影试剂，化学发光、显影。Alpha Innotech? Fluor Chem FC2凝胶成像系统采集图像，用Image J软件对条带计算蛋白表达的灰度值。以目的蛋白/GAPDH表示蛋白相对表达量。
　　1.9  统计学方法
　　 采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，采用方差分析，服从正态分布且方差齐时组间比较用LSD-t法，方差不齐时用Welch检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2  结果
　　2.1  HE染色结果
　　 正常组大鼠腎小球结构完整，无明显萎缩，基底膜清晰，无融合现象;模型组大鼠肾小管明显扩张，肾小球萎缩，基底膜融合明显，间质胶原增生明显，炎性细胞浸润;电针组、两色金鸡菊组、电针+两色金鸡菊组和二甲双胍组大鼠肾小管扩张较模型组均有所缓解，肾小球皱缩现象有所减轻，炎性细胞浸润改善，基底膜增生和融合减轻。电针+两色金鸡菊组改善更明显。见图1。
　　2.2  Western blot检测结果
　　 与正常组比较，模型组大鼠肾组织Vimentin、α-SMA、TGF-β1和p-smad2蛋白表达明显升高（P<0.01）;与模型组比较，两色金鸡菊组和电针+两色金鸡菊组大鼠肾组织Vimentin、α-SMA和TGF-β1蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01），其中电针+两色金鸡菊组作用最明显。见图2、图3。
　　3  讨论
　　 DN是糖尿病患者最常见、最严重的并发症之一，治疗不及时可导致终末期肾病，危及生命安全。然而，针对本病，目前仍缺乏特异性的治疗措施，临床上多采用控制血糖、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂等对症治疗，疗效有限，并不能完全遏制本病的发展及恶化。
　　 本病属中医学“消渴”“水肿”“尿浊”等范畴，在脏腑多与脾、肾相关，其病机主要为气阴两虚。目前已有大量研究显示，中药、针灸对本病均有一定疗效[7-9]。常用中药主要有黄芪、雷公藤等，常用穴位有肾俞、足三里、三阴交、太溪、关元、脾俞、阴陵泉、合谷、中脘、太冲等[10]。两色金鸡菊又称雪菊，原产于美国，近年来研究发现，其可显著抑制高糖高脂诱导大鼠肾小球系膜细胞中纤维化因子的表达，减缓DN的进展[5]。 　　 本研究结果显示，电针、两色金鸡菊提取物均可降低糖尿病大鼠肾脏中Vimentin、α-SMA蛋白的表达，2种治疗方法对DN均有显著疗效，而两者联合其疗效优于单一疗法，在降低Vimentin、α-SMA蛋白表达的同时，伴有TGF-β1及p-smad2蛋白表达下降，说明电针和两色金鸡菊提取物可能是通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路发挥作用的，且两者联合对改善糖尿病大鼠的肾功能具有协同作用。
　　 DN发病机制尚不完全清楚，研究表明，TGF-β1/smads信号通路与本病的发生发展密切相关[11]。TGF-β1属于TGF-β家族，其表达水平过高可引起肾脏中成纤维细胞增长加快、细胞外基质产生增多，最终引起肾脏的纤维化。研究表明，针对TGF-β1进行干预可明显改善糖尿病肾损害，是改善DN的一个有效靶点[12]。本研究结果也显示，造模后，大鼠肾组织TGF-β1表达较正常组明显升高，该结果与上述研究结果类似。经电针及色金鸡菊提取物干预后，TGF-β1水平明显下降，表明电针及色金鸡菊提取物对TGF-β1均有抑制作用。TGF-β1的下游有多种信号通路，Smad是TGF-β1下游信号转到的分子之一，主要包括Smad1～8，而Smad2被证明与DN的发病高度相关[13]。TGF-β1可磷酸化Smad2，活化的Smad2可与Smad4形成复合体，进入细胞核后引起肾脏纤维化相关蛋白的表达，进而引起肾脏损伤。本研究中模型大鼠p-smad2表达较正常组明显升高，与其他研究结果一致[14-15]。经电针及色金鸡菊提取物干预后，p-smad2水平明显降低，表明电针及色金鸡菊提取物可明显抑制TGF-β1下游Smad2的表达。因TGF-β1/Smad2信号通路在DN中发挥重要作用，本研究推断，电针联合金鸡菊提取物可通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路发挥肾脏保护作用，且其疗效优于单一疗法，两者具有协同作用。张楠楠等[16]研究也表明，TGF-β1/Smad2信号通路在两色金鸡菊提取物改善糖尿病肾纤维化方面起着重要作用。
　　 综上，本研究认为电针联合两色金鸡菊提取物可降低糖尿病肾脏纤维化相关蛋白的表达，发挥肾脏保护作用，两者具有协同作用，其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad2信号通路有关。
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　　（收稿日期：2018-11-06）
　　（修回日期：2019-04-03;编辑：华强）
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