喷淋秋水仙素加倍玉米单倍体籽粒最适条件及应用效果研究

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　　关键词：玉米;喷淋法;加倍率;单倍体;秋水仙素
　　玉米常规方法育种选育自交系，周期比较长、速度比较慢，限制了玉米品种研发和更新速度。以玉米孤雌诱导系为基础的双单倍体（DH）育种技术可以有效地缩短育种年限，加快育种进程，为种质的改良和新品种的选育提供重要的技术支撑[1-2]。DH育种技术已经在国际多家单位中得到大规模的应用[3]，我国很多单位也相继开展了单倍体育种技术研究和应用。
　　玉米单倍体育种技术已经成为国际研究热点之一，随着诱导基因的精细定位和机制的揭示，产生单倍体的理论基础得以进一步明确，它已是培育玉米新材料和新品种的最高效的技术手段[3]。然而，单倍体自然加倍成二倍体比较困难，即加倍率低，目前加倍率达10%是很难实现的[4-6]。Wan等研究报道，许多玉米种质单倍体植株自然加倍率低于5%，有些种质甚至根本不发生自然加倍[7-8]。我国早期单倍体加倍以自然加倍为主，由于自然加倍率低不能满足生产的需要，现阶段主要以化学加倍为主。要获得大量玉米DH系，才能达到选优的目的，必须借助单倍体人工染色体加倍技术体系。秋水仙素是目前应用较广泛的染色体加倍药剂之一，能有效地抑制细胞分裂过程中纺锤丝的形成，促使细胞染色体数目加倍，在玉米单倍体加倍中得到广泛应用。关于玉米单倍体化学加倍技术和方法的报道较多[9-12]，人们对秋水仙素施用的浓度和方法进行了探索，主要有浸泡法、注射法或滴心法、喷淋法等。姜龙等研究的秋水仙素加倍甜玉米单倍体试验表明，对玉米单倍体植株伤害较严重，有浸芽法和针刺生长点法，存活率不超过50%[13]。浸泡法由于泡在药液中，时间短效果不明显，时间长容易进行无氧呼吸降低成活率;注射法或滴心法需要大量的人工，人员长时间接触秋水仙素不安全;而喷淋法操作简便，自动化程度高，便于大规模应用，减少人员与秋水仙素的接触时间。秋水仙素喷淋法的加倍效果如何，是否达到预期的目的需要进行验证。
　　在借鉴和学习前人研究基础上利用自制喷淋加倍设备，对秋水仙素喷淋单倍体幼苗的最佳加倍浓度和时长进行了研究，并在最适条件下研究了不同种质材料的喷淋加倍应用效果，为秋水仙素喷淋法加倍单倍体籽粒的应用提供参考价值。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　组1：选用迪卡516（XL21×H2671）为母本，父本诱导系为辽诱1号，诱导产生的单倍体籽粒为试验材料，研究秋水仙素喷淋处理玉米单倍体幼苗的最适浓度和时长。
　　组2：选用表1中不同种质材料为母本，父本诱导系为辽诱1×CAUHOI3的杂交种，诱导产生的单倍体籽粒为试验材料，研究秋水仙素喷淋对不同种质的加倍效果。
　　1.2 试验方法
　　试验采用喷淋法：挑选后的单倍体籽粒先采用沙培法催芽，当幼苗芽长约2 cm时用剪刀将幼芽顶端胚芽鞘切掉（距离中胚轴5～10 mm），将幼苗装入漏水的塑料筐内，放入喷淋秋水仙素的加倍设备中，如图1所示，为了避免喷淋装置上下层不均匀的问题，将该试验的材料全部放在最上面的一层，加倍环境均匀一致。喷淋秋水仙素，然后换成清水进行喷淋洗苗。将其移栽至大田，用完全随机两因素3次重复设计。采用喷灌的方式移植大田，计算植株成活率;开花期套袋自交，收获后计算加倍率。
　　植株成活率=成活单倍体株数/出苗的种子 数×100%;加倍率=自交结实的单倍体植株数/总单倍体植株数×100%。
　　试验分2组进行。
　　组1试验：2018年4月底在沈阳加倍处理，设置秋水仙素浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，设置喷淋时长分别为6、8、10、12、14 h。
　　组2试验：2018年5月在沈阳，以11个不同种质材料为母本、孤雌生殖诱导系辽诱1×CAUHOI3的雜交种为父本诱导产生的单倍体籽粒为试验材料，2018年11月在辽宁省农业科学院海南佛罗玉米育种基地（108°46′E、18°36′N）进行，秋水仙素浓度为0.625 mg/mL，喷淋时长为10 h，将11个基础材料的单倍体籽粒分成2份，每份中设3次重复：一份进行直接播种，出苗后用剪刀减掉芽尖，喷淋适量清水;另一份出苗后剪掉芽尖后进行秋水仙素喷淋加倍处理。
　　1.3 数据处理
　　试验数据在Excel 2007软件中整理，方差分析用DPS 7.05统计软件的双因素、单因素方差分析和Duncan多重比较。
　　2 结果与分析
　　2.1 秋水仙素喷淋法有利于提高幼苗的成活率
　　由表2可知，2018年秋水仙素喷淋浓度为 0.4 mg/mL、喷淋6 h的植株成活率最高，达 91.3%;秋水仙素浓度为0.6 mg/mL、喷淋6 h的植株成活率居第2位，为88.6%;秋水仙素喷淋浓度为1.2 mg/mL、喷淋14 h的植株成活率最低，为 62.7%。喷淋时长为6 h的幼苗成活率均值为 83.7%，喷淋时长为14 h的幼苗成活率均值为 68.5%;秋水仙素喷淋浓度为0.4 mg/mL的幼苗成活率均值为83.5%，秋水仙素喷淋浓度为 1.2 mg/mL 的幼苗成活率均值为68.8%。喷淋法有充足的氧气供应，成活率下降较慢。
　　由表3可知，2018年单倍体幼苗平均加倍率与喷淋浓度的关系为：0.6 mg/mL>0.8 mg/mL>1.0 mg/mL>0.4 mg/mL>1.2 mg/mL;单倍体幼苗平均加倍率与喷淋时长的关系为：10 h>8 h>12 h>14 h>6 h。秋水仙素喷淋浓度为 0.6 mg/mL、喷淋10 h处理的单倍体幼苗加倍率为17.5%;秋水仙素浓度为0.6 mg/mL、喷淋8 h处理的单倍体幼苗加倍率为16.2%。试验表明，秋水仙素喷淋浓度为0.6 mg/mL、喷淋时长为8～10 h的加倍效果较好。
　　由表4可知，喷淋秋水仙素的浓度和时长对加倍率的影响都达到了极显著水平。浓度的方差为167.60，时长的方差为30.97，说明喷淋秋水仙素中时长效应小于浓度效应。 　　2.2 秋水仙素喷淋法的加倍效果比较明显
　　由表5可知，2018年冬在海南的自然加倍率为0.55%～7.69%，秋水仙素喷淋的加倍率为 1.68%～21.33%，平均自然加倍率为2.46%，喷淋秋水仙素处理的平均加倍率为9.29%。P9的自然加倍率为7.69%，喷淋秋水仙素处理的加倍率最高，为21.33%，为对照的2.77倍;排在第2位的是P11，自然加倍率为3.03%，喷淋秋水仙素处理的加倍率为17.05%，为对照的5.63倍;最低的是P1，自然加倍率仅为0.55%，喷淋秋水仙素处理的加倍率为1.68%，为对照的3.05倍;第2低的是P2，自然加倍率为0.71%，喷淋秋水仙素处理的加倍率为 4.48%，为对照的6.31倍。在1%水平上，P9（SS-NSS种质）的差异只与P1（SS种质）的差异达到极显著水平;在5%水平上，P9（SS-NSS种质）、P11（NSS种质）与P1（SS种质）差异显著，说明秋水仙素喷淋加倍的效果明显，但不同遗传背景之间的自然加倍率差异较大，喷淋秋水仙素对所有试验材料的加倍率都有提高作用。
　　2.3 秋水仙素喷淋法对不同种质的加倍效果不同
　　由表6可知，秋水仙素喷淋法加倍效果与直接播种自然加倍相比达到了极显著水平，不同种质的遗传特性在10%的水平上差异显著，喷淋秋水仙素效应大于遗传效应，自然加倍高的材料，秋水仙素处理后加倍率相对较高，存在一定的正相关。自然加倍率由高到低为SS-NSS种质、NSS种质、SS种质。
　　如图2所示，秋水仙素喷淋法对单倍体籽粒加倍效果有明显提高，是对照的1.54～9.44倍，为对照平均值的4.93倍。自然加倍率的平均值：SS-NSS种质（4.49）﹥NSS种质（2.38）﹥SS种质（148），喷淋秋水仙素加倍率的均值：NSS种质（16.67）﹥SS-NSS种质（10.98）﹥SS种质（598），喷淋秋水仙素加倍率的提高的倍数：NSS种质（6.00）﹥SS种质（3.04）﹥SS-NSS种质（145）。秋水仙素喷淋法对全部试验材料都有提高作用，是一种有效的加倍方法，利用该喷淋设备加倍单倍体籽粒的方法简便易行，安全性好。
　　3 讨论与结论
　　3.1 单倍体籽粒自然加倍率低
　　单倍体自然加倍率已经在业内形成共识。王贺等研究单倍体自然加倍的情况发现，自然加倍率低于2.0%[14]。张坤明等研究表明，单倍体自然加倍率较低，仅为2.5%[15]。蔡泉等研究不同种质和不同地点对自然加倍率的影响，获得的自然加倍率范围为3.88%～9.94%[16]。王文洁等研究玉米单倍体籽粒在自然加倍条件下，显花药率可达12.7%～57.2%，但是单倍体结实率只有1.0%～7.2%，而且有些单倍体经过多次授粉后仍不能自交结实[17]。本研究中，2018年冬季海南不同种质的自然加倍结实率也比较低，仅为0.55%～7.69%，因此， 单倍体的自然加倍直接应用比较困难，急需研究有效的人工加倍技术。
　　3.2 处理加倍的成活率
　　试验处理后的成活率是加倍率的基础。文科研究浸种法、注射法浸根法和浸芽法的加倍效果，结果发现浸根法和浸芽法的植株受害情况比较严重[18]。姜龙等研究爆裂玉米单倍体加倍方法中，成活率分别为浸根法的25.6%～39.3%、浸芽法的48.4%～78.6%、滴心叶法的26.6%～54.8%、针刺生长点法的38.2%～59.6%，总体来看这些方法成活率较低[19]。刘晓鑫等研究不同种质用秋水仙素加倍中，成活率从89.3%下降到46.9%，下降比较明显[20]。本研究采用秋水仙素喷淋法，保持了幼苗水分和氧气的充足供应，不会出现厌氧的情况，成活率在62.7%～91.3%，成活率较其他方法明显提高。
　　3.3 秋水仙素喷淋法效果
　　秋水仙素喷淋加倍率受到遗傳基础的影响，存在一定的正相关。本研究结果表明，不同种质的玉米单倍体幼苗喷淋秋水仙素加倍效果明显高于自然加倍率。试验中喷淋秋水仙素加倍不同种质的加倍率为1.68%～21.33%，加倍率为对照的 1.54～9.47倍，秋水仙素喷淋法的加倍效果明显、普遍适用。而且该方法操作简便，减少人员对秋水仙素的接触，废液便于回收，有利于保护环境，有一定的推广应用价值。
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