单倍体育种技术在玉米种质创新上的应用与实践

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　　摘要    本文从单倍体育种的特点和优势出发，阐述了单倍体育种技术在国内外的发展现状及其在玉米种质创新上的应用方向，提出在张掖市利用单倍体育种进行玉米种质改良的独特优势，为今后开展单倍体育种、加快玉米种质创新提供参考。
　　关键词    玉米;单倍体育种;种质创新
　　中图分类号    S513;S336        文献标识码    A        文章编号   1007-5739（2019）10-0032-02
　　Abstract    Based on the characteristics and advantages of haploid breeding，this paper introduced the development status of haploid breeding technology at home and abroad and the direction of application on maize germplasm innovation，put forward the unique advantages to develop haploid breeding in Zhangye City，in order to provide reference for haploid breeding and accelerates maize germplasm innovation in the future.
　　Key words    maize;haploid breeding;germplasm innovation
　　玉米是我国也是我国种植范围最广、用途最多、产量最高的作物，通过生物育种实现节本增效是提高玉米产业国际竞争力的关键技术。单倍体育种技术现已成为与分子标记辅助育种技术、转基因育种技术相媲美的三大生物育种技术之一，又因其快速、高效、可操作性强等特点成为国内外各大种子公司选系及工程化、商业化育种的重要手段。
　　1    单倍体育种的优势及发展现状
　　1.1    单倍体育种的优势
　　单倍体育种是指利用孤雌生殖、孤雄生殖和无配子生殖产生单倍体，再经过染色体加倍恢复育性，从而获得纯合自交系的育种方法。单倍体的特点有以下几个方面：①只有1组染色体，单倍体染色体的加倍，相当于同质结合，仅需2代就能得到遗传上稳定，性状不分离的二倍体纯系植株;②具有个体生长发育所必需的全套基因，在适宜条件下可以正常生长;③植株矮小、叶面积小、花器较小、高度不育，因而不能产生正常种子，不能直接应用，加倍后才能用于育种[1]。
　　单倍体的特点决定了它是极为珍贵的育种材料。一是单倍体经染色体加倍形成的纯合二倍体，性状稳定，仅需2代即可获得100%纯合的材料，而常规育种获得稳定的育种材料需要6～8代;二是不同于杂合体，单倍体形成的纯合二倍体没有显性性状的遮盖，淘汰不利隐性性状更为便利，从而获得优良纯合个体;三是加倍后的DH（doubled haploid）系可以直接用于育种，同时也是基因定位等遗传研究的好材料，也可以作为转基因的受体[2]（表1）。
　　单倍体育种通过育种顶层设计，整合育种资源，以系统科学思想为指导，以工程思维和技术方法为手段实现育种目标。单倍体可以实现工程化育种，从而解决我国种业育种体系不健全、没有完整的产业技术链、以经验为主导的育种模式，起到优化育种产业技术链、加强设计育种、减少育种过程对经验的依赖。单倍体育种系统的关键在于其生产过程完全可以从育种企业独立出来，由第三方公司代生产，提高了资源利用效率，降低了生产成本。
　　1.2    单倍体育种技术在国内外发展现状
　　自1921年人类首次从曼陀罗花药培养中获得单倍体植株后，单倍体育种技术先后在烟草、白菜型油菜和甘蓝型油菜中成功应用。截至20世纪80年代，已在玉米、水稻、棉花、番茄、小麦和油菜等70个属、206 种作物中得到了单倍体。但单倍体自然发生机率仅为0.05%～0.10%，远不能适应规模化商业育种的需求。如何進一步提高诱导频率，将单倍体育种技术与杂交育种、诱变育种、远缘杂交等结合应用，仍然是育种家们在未来几年研究的重点方向。
　　单倍体可以自发产生或者利用植物雌、雄配子组织培养产生。目前，获得单倍体主要有2种方式：一是植物单倍体组织离体培养;二是孤雌生殖，包括远缘杂交、化学诱导、辐射诱导、诱导系杂交诱导。在我国广泛应用的则为花药培养和诱导系杂交诱导。
　　花药培养技术主要应用在十字花科作物（如油菜）中，在小麦和大麦等禾本科作物上也有报道，但仅限于个别易诱导的特殊基因型上，离规模化应用还有较远的距离。
　　诱导系杂交诱导获得单倍体是玉米获得单倍体的主要方法。Stock6是最早发现的孤雌生殖诱导系。但由于其诱导率较低，不少学者在它的基础上进行遗传改良，选育出WS14、KMS、ZMS、MHI、RWS等高频诱导系[2]。我国第1个单倍体诱导系是中国农业大学选育的农大高诱导1号，打破了国外对单倍体诱导系的垄断。随后，不少综合性状优良、诱导频率高且稳定的单倍体诱导系不断被创制出来。农大高诱5号诱导率超过8%，且诱导率稳定，籽粒色泽标记清楚，农艺性状和繁殖性能均较好。吉林省农业科学院育成的吉高诱3号，诱导率最高可达15.94%[3]。此外，带有新的籽粒高油、黄绿色苗等的诱导系也即将（或已）投入使用[4]。这种诱导方式要攻克的难题在于不断选育出新型诱导材料，大幅提高诱导率或使准单倍体的鉴别技术趋于简化。 　　单倍体的鉴定方法包括遗传标记鉴定法、形态学鉴定法、细胞学鉴定法、解剖学鉴定法、流式细胞仪鉴定法、分子标记鉴定法和生理生化鉴定法。
　　形态学鉴定法虽然直观简便，但需要植物生长发育到某个特定的时期才能进行检测，对于生长周期较长的木本植物检测周期过长。玉米由于诱导系自身携带有籽粒色泽和植株色泽标记基因，用此方法鉴定单倍体准确率可高达98%。细胞学鉴定能直接反映植株的倍性，是鉴定植株倍性最准确、最有效的方法。目前，用流式细胞仪可快速检测植物的倍性，且适合于多种植物。但该设备费用较高，不适于实验室使用。分子标记鉴定法利用标记位点鉴定植物倍性，所用仪器设备简单、便于操作，是目前应用最广泛的单倍体检测方法。常见单倍体加倍方法为自然和人工加倍2种。自然加倍一般概率较低，易受环境和基因型等因素的影响，规模化应用时不建议采用。人工加倍是恢复单倍体倍性的主要方法。一般用秋水仙素诱变剂进行浸根、浸芽、浸泡分蘖等人工加倍方法。研究发现，用植物生长调节剂或有机化学物质也能诱导染色体加倍。近年来还有报道，加入萘嵌戊烷和一些除草剂类物质也可使植物染色体加倍[5]。
　　2    单倍体育种技术在玉米种质改良上的应用
　　2.1    快速选育DH系
　　单倍体育种技术可在2个世代内得到100%纯合的玉米自交系，再经过2年的测交组合试验，从选育自交系到育成杂交种只需4年时间，与常规育种相比省工省时，可以明显缩短育种周期[2]。
　　双单倍体植株每一品系都一个纯合的二倍体材料，可进行稳定繁殖，且无显性和隐性互作的干扰，在各种环境下均可以进行重复试验。与常规法相比较，采用该群体进行数据收集可减小环境的误差，消除了早代竞争的影响，大大提高了QTL定位的准确性。利用双单体群体可快速建立近等基因系，并对这些位点的作用机理进行深入研究[3]。
　　2.2    群体改良
　　常规育种中轮回选择基础群体中若某个体基因型杂合程度高，被选择后在带入有利基因的同时也带入大量隐性的有害基因。而单倍体育种技术可消除这种显性基因对隐性基因的遮盖，增加选择的准确性，提高选择效率。同时，单倍体雌穗在进行广泛分离的过程中，其分离的选择以及种质在一定的程度上为玉米种质创新提供了可能性。
　　2.3    突变体的筛选
　　单倍体只有一套染色体，没有显隐性关系，易受外界环境的影响产生突变。突变可在自交系1～2代进行鉴定，经加倍处理，突变位点纯合，是选择良好突变材料的基础。同时，如果能从突变体中选出有利变异对其进行改良，为优良基因的选育提供变异材料，则有利于玉米种质创新和遗传研究。
　　2.4    杂交种亲本材料提纯复壮
　　亲本种子纯度是玉米制种的关键因素之一，直接影响杂交种的使用价值。多年繁殖后，亲本原来的优良性状会逐渐减弱或消失，严重时失去应用价值。而使用单倍体育种技术产生单倍体，然后加倍形成DH系，使发生混杂或退化的玉米种子亲本恢复其纯度和优良特性。
　　2.5    提高亲本选择效率
　　单倍体育种技术能提高目标性状选择的准确性。在单倍体时期，结合目标性状进行有效选择，可在一定程度上减轻工作量，具有一定的可行性或准确性。同时，还能有利于DH系鉴定等后续相关的工作，并能帮助育种人员选育出性状优良的玉米新品种。
　　3    张掖发展单倍体育种的独特优势
　　3.1    生态条件好，单倍体诱导和加倍率高
　　张掖市位于河西走廊中部，地理坐标为东经97°20′～102°12′、北纬37°28′～39°57′，海拔1 200～5 565 m。常年干燥少雨，蒸发量大，日照长、太阳辐射强，年平均日照时数为3 052.9 h，≥10 ℃的活动积温2 980 ℃，正常年份无霜期为152 d，昼夜温差大，被誉为“天然种子生产王国”[6]。耕地多以灌漠土为主，土壤疏松，通透性好，蓄水保肥能力强，耕性良好，适宜各类作物栽培种植。研究表明，生态环境对单倍体的加倍率有显著影响，在海南三亚的单倍体诱导率和加倍率显著高于长春、长岭，三亚更适合玉米单倍体诱导和加倍[7]。而周玉乾等[8]对海南三亚、甘肃陇南、甘肃张掖3个不同生态区单倍体自然加倍率研究发现，在甘肃张掖单倍体自然加倍率最高，可达5.4%。张掖市农业科学院通过多年的育种实践表明，在甘肃张掖地区进行玉米单位体诱导，单倍体遗传标记能够在籽粒中充分发育，表达较好，自然加倍率高于国内其他地区。同时，张掖地区授粉期降雨量少，结实较好，籽粒饱满，有利于后代植株生长，诱导率介于10%～16%之间，最高可达16%，高于海南等地。甘肃张掖地区是单倍体诱导和加倍的最佳地区。
　　3.2    种质资源丰富，诱导基础材料广泛
　　张掖作为我国农作物制种的精华地带，拥有各类种子企业80多家，每年有杂交玉米、蔬菜、花卉、油菜制种面积约10万hm2，有各类作物品种1 000多个，为张掖市农作物种质资源的收集奠定了基础。如果将这些种质资源收集起来作为单倍体育种诱导的基础材料，是丰富诱导基础材料和提高诱导率的关键。研究表明，不同遗传背景的基础材料对单倍体诱导率存在影响，母本基因型不同单倍体诱导率存在差异[9];不同杂交模式下玉米基础材料的单倍体诱导率不同[3]。研究人员如果将收集到的种质资源进行杂种类群划分，按高诱导率的杂交模式进行基础材料杂交，这样不但可以让育种者掌握基础材料的来源，也能提高诱导率。
　　单倍体育种是商业化育种的主要方式，杜邦先锋种业、奥瑞金种业、甘肃金源种业等大型企业的单倍体育种已初具规模化，单倍体生产总数在百万以上，在张掖已建立了大型的单倍体育种基地，极大地丰富了甘肃省种质资源。同时，将单倍体育种技术与二环系选育、回交育种、轮回选育等传统育种技术相结合，对创新作物种质资源、培育作物新品种起到了积极作用，在张掖开展单倍体工程化育种意义深远。
　　4    参考文献
　　[1] 张姿丽.玉米Stock6衍生系诱导单倍体的机理研究[D].武汉：华中农业大学，2008.
　　[2] 陈绍江，黎亮，李浩川，等.玉米单倍体育种技术[M].2版.北京：中国农业大学出版社，2012.
　　[3] 赵向田.玉米单倍体育种理论与实践[M].北京：中国农业科学技术出版社，2017.
　　[4] 刘培勋，刘和平，罗仁革，等.单倍体诱导技术在玉米育种中的应用[J].种子，2014，33（5）：49-52.
　　[5] 郑永强，徐坤.秋水仙素在植物体细胞染色体加倍中的应用研究进展[J].中国农学通报，2013，19（5）：89-91.
　　[6] 苏建东，张东昱，杨勇.推动张掖玉米种子品牌战略研究[J].农业科技与信息，2014（22）：18-20.
　　[7] 姜龙，慈佳宾，崔学宇，等.不同生态条件下玉米单倍体诱导率和加倍率研究[J].玉米科学，2015，23（1）：139-143.
　　[8] 周玉乾，寇思榮，连晓荣.不同生态区玉米单倍体自然加倍率研究[J].甘肃农业科技，2016（6）：5-7.
　　[9] 徐国良，代玉仙，刘晓丹，等.玉米单倍体诱导率和加倍率研究[J].玉米科学，2012，20（2）：1-5.
　　基金项目   甘肃省青年科技基金（18JR3RG425）。
　　作者简介   王婵（1984-），女，甘肃平凉人，农艺师，从事玉米遗传育种工作。
　　通信作者
　　收稿日期   2019-01-30
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