木贼镰刀菌最适营养条件筛选

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　　摘 要：以菌落生长速率、菌落直径及产孢量为指标，从5种常用培养基中筛选最适合木贼镰刀菌生长的培养基，再通过正交试验对所选培养基进行优化。结果表明，木贼镰刀菌在SDAY培养基上生长最快，速率达6.736mm·d-1;直径最大，为56.33mm;产孢量最大，达到3.66×107cfu·mL-1。正交试验优化后，最适合木贼镰刀菌生长的培养基成分为蛋白胨10g、葡萄糖48g、酵母粉1.5g、琼脂15g、蒸馏水1L。
　　关键词：木贼镰刀菌;培养基;菌落直径;产孢量;正交实验
　　中图分类号 Q 939.5 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）（02-03）0024-03
　　Fusarium equiseti most Suitable Nutrition Condition Screening
　　Pei Shuangkang et al.
　　（Lvliang College of Life Sciences Department， Lvliang 033000， China）
　　Abstract： With the Fusarium equiseti as the research object， the growth rate， the diameter of the colony and the production of spores were the index， the medium best suited for its growth was selected from several commonly used mediums， and the selected medium was optimized by orthogonal test. The results showed that the F.equiseti grew fastest on SDAY， with a rate of 6.736 mm d-1， the largest diameter， 56.33 mm， and the largest spore production， reaching 3.66 x 107 cfu mL-1. After optimization through orthogonal testing， the most suitable medium components for the growth of  F.equiseti are protein sucrose 10 g， glucose 48 g， yeast powder 1.5 g， agar 15 g， distilled water 1 L.
　　Key words： Fusarium equiseti; Medium; Colony diameter; Spore production; Orthogonal experiment.
　　木賊镰刀菌（Fusarium equiseti）是一种重要的虫生真菌，分布方泛。木贼镰刀菌能产生植物刺激素，如赤霉素等，这些刺激素可使农作物在一定程度上增产[1]，而且部分可产生纤维酶、果胶酶、脂肪酶等具有极大应用价值的酶类。
　　1986年有研究初步表明：木贼镰刀菌在人工培养基上生长良好，对菜青虫有较高的致病力，具有田间使用价值[1]。2013年有研究表明：黄海海域海蜇的共生微生物包括木贼镰刀菌，并通过实验确定了其4个次生代谢产物，包括Alternariol，Djalonensone，腺嘌呤核苷和过氧麦角甾醇，其中过氧麦角甾醇具有广泛抗痛、抑菌等生物活性[2]。本研究以木贼镰刀菌为研究对象，以菌落生长速率、菌落直径及产孢量为指标，从5种常用培养基中筛选最适合其生长的培养基，通过正交试验优化后，得出最适合木贼镰刀菌生长的培养基成分，为此菌的扩大培养提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 菌种供试 菌株：木贼镰刀菌，试管斜面保存于4℃的冰箱中。使用时，取出活化，接种于PDA培养基，置于28℃生化培养箱中培养，待制作孢子悬浮液。
　　1.1.2 培养基 5种培养基成分见表1。
　　1.1.3 仪器与设备 BSA224S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;HZJK-1 KDM型控温电热套，山东鄄城华鲁仪器公司;YX-24LDJ手提式压力蒸汽灭菌器（简），江阴滨江医疗设备有限公司;HH0-C1112B超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司;SPX-250生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司;SMART生物显微镜，重庆奧特光学仪器有限公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 扩大培养 将保存于4℃冰箱试管斜面上的木贼镰刀菌取出活化，并接种于PDA培养基中，置于28℃生化培养箱培养。5d后，待其长满整个培养皿2/3，即可用于制作孢子悬浮液。
　　1.2.2 接种及菌落直径测定 按照表1中的5种培养基配方进行培养基配制，每种培养基在灭菌后分别倒至5个培养皿内，以做重复。取出已长满培养皿2/3的木贼镰刀菌，用无菌水将其制作成孢子悬浮液，用灭菌的滤纸片（直径约5mm）蘸取孢子悬浮液，置于培养皿中心，倒置于28℃生化培养箱中培养[3-5]。接种后，从第2d开始，每天同一时间双向测量菌落直径，取平均值并记录，最终计算其生长速率，期间观察各培养皿的菌落形态特征。
　　1.2.3 产孢量测定 用灭过菌的打孔器在各培养基的菌落上打5个孔，再将5个菌饼置于5mL无菌水中，搅拌均匀，用2层灭菌的纱布过滤，滤液即为孢子悬浮液。利用血球计数板进行计数，根据公式计算其产孢量[6]。
　　1.2.4 正交实验 在确定了最适合木贼镰刀菌生长的培养基之后，针对其配方，选择蛋白胨，麦芽糖，酵母粉作为3个试验因素，每个因素设置3个水平，进行正交试验，记录菌落直径与产孢量。 　　1.3 数据处理 将前8d测量得到的数据用excel进行处理，绘图，得到回归方程：再将第9d所得产孢量数据用SPSS17.0（中文版）数据处理系统进行统计学分析，计算均值及标准误差，随后均值差异显著性通过Duncan新复极差法进行多重比较分析。数据处理分析所得回归方程用SPSS线性回归分析得出，回归方程斜率即为菌落生长速率[7-9]。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同培养基对木贼镰刀菌菌落生长及产孢量的影响
　　2.1.1 不同培养基对木贼镰刀菌菌落生长的影响 木贼镰刀菌在5种不同培养基上的菌落直径及回归方程见表2。从表中可以看出木贼镰刀菌在不同培养基上的菌落直径（P=0.002）不同。在PSA培养基上木贼镰刀菌生长速度最慢，只有5.348mm·d-1，菌落直径也最小，只有44mm。在SDAY培养基上，木贼镰刀菌菌落生长与其他处理差异显著，菌丝生长最快，生长速率达到了6.736mm·d-1，菌落直径最大，最终直径为56.33mm。
　　2.1.2 不同培养基对木贼镰刀菌产孢量的影响 木贼镰刀菌在不同培养基上的产孢量见表3。从表3可以看到，木贼镰刀菌在5种培养基上的产孢量（P<0.001）不同。在PDA培養基上木贼镰刀菌的产孢量最小，只有1.57×107 cfu·mL-1，而在SDAY培养基上木贼镰刀菌的产孢量与其他处理差异显著，产孢量最大，达到3.66×107cfu·mL-1。
　　2.1.3 适合木贼镰刀菌生长的培养基 由上部分实验所得数据及表4分析结果，可知实验所选培养基中SDAY培养基上木贼镰刀菌生长最快，菌落直径最大，且菌落形态与其他处理有明显差异，说明SDAY是最适合木贼镰刀菌生长的培养基。
　　2.2 正交实验结果分析 由第1部分实验结果筛选出SDAY培养基，以蛋白胨、葡萄糖、酵母粉作为试验因素，每个因素设置3个水平，进行正交实验。因素水平表如下所示：
　　2.2.1 初步分析 对各培养基菌落形态观察结果如下：菌落呈圆形，中部凸起，蔓延生长，无孢子散落现象，边缘整齐，有明显的同心轮纹，菌丝颜色分层明显，最外围一圈白色菌丝，中心滤纸片位置为墨绿色，由内而外有淡黄色，灰色等。部分培养基正反两面颜色不同，可能由于培养基营养不够而导致培养基变色;还有部分培养基背面有放射状纹路;培养基成分不同，菌落颜色的变化也有不同程度的差异。
　　2.2.2 综合分析 正交实验所得数据综合分析结果如表6、7所示：以菌落直径为产量指标，极差分析表明，实验设置3个因素对木贼镰刀菌菌落直径的影响大小依次为：葡萄糖、酵母粉、蛋白胨。可见，葡萄糖对木贼镰刀菌菌落直径的影响最大。最终得出的最优方案为：蛋白胨10g，葡萄糖48g，酵母粉2.5g。以产孢量为产量指标，极差分析表明，实验设置3个因素对木贼镰刀菌产孢量的影响大小依次为：葡萄糖、酵母粉、蛋白胨。可见，葡萄糖对木贼镰刀菌产孢量的影响最大。最终得出的最优方案为：蛋白胨10g，葡萄糖48g，酵母粉1.5g。
　　综上所述，木贼镰刀菌的最适培养基配方为：蛋白胨10g，葡萄糖48g，酵母粉1.5g，琼脂15g，蒸馏水1L。
　　3 结论
　　本研究结果表明，在PDA、PSA、SDA、SDAY、SMAY5种培养基中，SDAY最适合木贼镰刀菌生长;最适合木贼镰刀菌生长的培养基配方是：蛋白胨10g，葡萄糖48g，酵母粉1.5g，琼脂15g，蒸馏水1L。
　　木贼镰刀菌在5种培养基及不同成分的SDAY培养基上均可生长及产孢，说明该菌对营养的需求较低，且对碳源要求不高，既可利用葡萄糖，又可利用麦芽糖、蔗糖。正交实验结果表明，葡萄糖对木贼镰刀菌生长的影响最大。由此可见，木贼镰刀菌可大规模培养，用于生产实践中。
　　参考文献
　　[1]苑森行，杨玉景.虫生真菌——木贼镰刀菌的初步研究[J].微生物学通报，1986（01）：13-14.
　　[2]张永刚，贾爱荣，袁文鹏，等.一株木贼镰刀菌的分离鉴定及次生代谢产物研究[J].食品工业，2013（08）：132-133.
　　[3]张启先，王媺芝，乐华爱，等.青霉素酰化酶产生菌的筛选和大肠杆菌AS1.76产酶条件的研究[J].微生物学报，1979（03）：302-308.
　　[4]陆晨.高产纤维素酶菌株的筛选及其产酶条件的优化[D].湖南：中南林业科技大学，2012.
　　[5]田召芳.抑菌性乳酸杆菌的筛选、应用及抑菌物质特性研究[D].山东：山东农业大学，2003.
　　[6]戎军.血球计数板及其使用方法[J].中学生物教学，2015（19）：41-43.
　　[7]庄贺，沈俊剑，黎俊，等.氧化亚铁硫杆菌的分离鉴定及培养条件优化[J].微生物学通报，2013（07）：1131-1137.
　　[8]余祖华，丁轲，刘赛宝，等.一株降解呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的筛选与鉴定[J].食品科学，2016，37（05）：121-125.
　　[9]田晶，梁丽，孟豪，等.玫烟色棒束孢IF-1106菌株培养条件研究[J].山西农业大学学报（自然科学版），2014，34（2）：124-128.
　　[10]黄蓉姿，万金泉，马邕文，等.正交实验选择纤维素酶产生菌的最优综合培养条件[J].中国环境科学，2012（01）：130-135.
　　（责编：张 丽）
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