产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展

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　　摘  要：纤维素酶来源广泛，其中微生物繁殖快、发酵周期短，更适合大规模生产。通过采用理化诱变，原生质体融合，基因工程等技术可进一步筛选出高产纤维素酶的菌种。该文综述了目前关于产纤维素酶菌的研究进展，并对常用的筛选改良菌种的方法进行分别阐述，对比各方法间的优势和局限性，以期为后续研究者提供一些参考。
　　关键词：产纤维素酶菌  纤维素酶  理化诱变  酶活力
　　中图分类号：Q93-31   文献标识码：A             文章编号：1672-3791（2019）06（c）-0187-02
　　Abstract： Cellulase has a wide range of sources， and microbial fermentation is more suitable for large-scale production because of its rapid reproduction and short cycle. High cellulase-producing strains can be further screened by physical and chemical mutagenesis， protoplast fusion and genetic engineering. This review summarized the current research progress on cellulase-producing strains， and elaborates the commonly used methods of optimizing and screening improved strains， comparing the advantages and limitations of each method， in order to provide some reference for the future researchers.
　　Key Words： Cellulase-producing strains; Cellulose; Physical and chemical mutagenesis; Cellulase activity
　　纤维素酶是一种多组分的复合酶系，可将天然的纤维素降解成为小分子的糖类。在农业废弃物处理、食品加工、纺织、造纸业、环境保护等领域具有很大的应用价值。
　　目前已发现的产纤维素酶菌众多，但从自然界中直接分离到的产纤维素酶菌通常产酶量少、活性低，一般无法直接应用到工业化生产，因此常需要定向优化筛选，分离得到产酶量高且酶活力更加稳定的最优化型菌株，从而减少生产成本。实验室通常采用理化诱变、原生质体融合以及构建基因工程菌等方法进行菌株的改良，可显著提高菌株的产酶量及产酶活性。
　　1  产纤维素酶菌
　　1.1 产纤维素酶菌的分离
　　自1912年Kellerma等首次从土壤中筛选出一株纤维素降解菌以来，各种降解纤维酶的菌种陆续被发现[1]，主要包括真菌、细菌和放线菌等。其中大多数的菌株主要从土壤中获得，此外食草动物的粪肥、秸秆、蘑菇基质等也可分离出产纤维素酶菌。
　　1.2 产纤维素酶菌的产酶特点
　　不同菌种纤维素酶的产生和作用方式有所不同，如细菌纤维素酶是胞表面酶，降解纤维素时需要细菌粘附在纤维素上，而真菌和放线菌则为胞外酶，不需要直接与纤维素接触即可在胞外环境通过水解酶机制和氧化机制来降解纤维素。细菌产生的纤维素酶一般需要在最适pH为中性至偏碱性环境下发挥作用，而真菌产生的纤维素酶一般则需要在偏酸性的环境下发挥作用。大部分产纤维素酶细菌为厌氧型，通过纤维素酶复合体的协同作用降解纤维素。放线菌产纤维素酶则大多数具有耐高温和耐碱性的特点。
　　2  产纤维素酶菌的优化筛选方法
　　2.1 理化因素诱变筛选
　　2.1.1  化学诱变
　　化学诱变主要通过使用亚硝基胍、硫酸二乙酯、羟胺等诱变剂对菌株进行处理来引起菌株基因突变，一般采用两种或两种以上诱变剂进行复合处理，增强诱变效果。如李希波等[2]用亚硝基胍和羟胺复合诱变青霉HK-003，筛选出一株高产纤维素酶菌株LX-435，产酶能力较原始菌株提高了2.08倍。
　　2.1.2  物理诱变
　　物理诱变主要包括紫外线照射、激光照射、微波、高能电子流照射、离子流注入等。
　　紫外线照射是通过使DNA分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，从而引起突变，是实验室常用的诱变筛选方法。通常为了提高紫外照射的突变率，也常采用原生质体紫外诱变技术。
　　激光诱变则是利用激光辐射的光、电、磁等的综合效应使菌株细胞DNA处于易突变的状态，再经历一系列断键、聚合、交联等的变化来产生突变。通常采用低功率长脉冲的氦氖激光，但传统的He-Ne激光诱变方法易损伤细胞，突变效率较低。飞秒激光具有脉冲持续时间短（10-15s）、瞬时功率大（1012W）、聚焦尺寸小（约200nm）的特点[3]，目前在微生物的诱变筛选中已经得以应用，但未见有报道用于产纤维素酶菌的诱变筛选。
　　高能电子流可引起菌种体内原子或分子的激发和电离，可以使菌种的遗传信息发生改变，引起突变[4]。离子注入则是通过离子注入设备将经高能加速的离子注入到菌体内来引起突变，目前常使用低能氮离子。
　　2.1.3 理化复合诱变
　　目前很多研究表明，将化学诱变与物理诱变方法结合可以提高正向突变率，例如兰时乐[5]等以绿色木霉突变株TP1202为出发菌株，用微波诱变和硫酸二乙酯、氯化锂诱变剂进行诱变，选育到1株纤维素酶高产菌株AS5，在适宜条件下，它产生的CMC酶活力和滤纸酶活力分别是出發菌株的107%和152.4%。 　　2.2 原生质体融合
　　原生质体融合主要是通过使用酶制剂将具有不同优良性状或在生物代谢功能上可以互补的两个菌株的细胞壁去除获得原生质体，并将其混合后通过助溶剂或电场作用互相凝集，发生细胞融合以实现遗传重组。采用原生质体融合没有受体和供体之分，既有核配又有质配，因此可以在很大程度上保留双亲基因组的完整性。
　　为了提高已筛选出的产纤维素酶菌的产酶能力，也常采用原生质体融合的方法将两株产纤维酶菌进行融合，但此种方法也具有一定局限性，目前一般只能用于两种菌的融合，且在融合的过程中随机性很大，融合过程不易于观察，同时在融合子的分离上也比较困难。不过随着技术的不断改进和完善，原生质体融合技术在改良菌种性状和优化筛选方面也将发挥更大的作用。
　　2.3 基因工程技术
　　目前纤维素酶的需求量越来越高，为了更加快速地获得纤维素酶，实现工业化生产，人们更加倾向于利用基因工程技术将纤维素酶的基因克隆到酵母、大肠杆菌等载体中，可在较短的时间内获得高酶活力的重组型纤维素酶。
　　纤维素酶的基因克隆从20世纪70年代开始，迄今为止，已经从近百个物种中克隆出纤维素酶基因，其中大多数来自于真菌和细菌。目前，对于里氏木霉基因研究较为深入，已克隆到了里氏木霉所编码纤维素酶的13个基因[6]。
　　但由于纤维素酶的复杂体系，基因工程技术仍具有局限性，所得到的酶一般为纤维素酶复合体的单个多肽组分，只具有几种纤维素酶的功能，不足以彻底降解纤维素，因此运用该技术获得完全的纤维素酶，并提高酶的活性仍具有一定的挑战性。
　　3  结语
　　优化筛选高产酶量的菌株，寻找合适的发酵工艺，探索使酶活更稳定的方法，是降解纤维素的当务之急。而在众多的优化筛选方法中，理化因素诱变筛选相对于其他方法的操作更为简便，但往往对于菌种的致死率高，正向突变率低，以及很多诱变剂都存在毒性甚至致畸变，对于操作人员的安全存在威胁，原生質体融合和基因工程技术则危险系数相对较低，但同时也有其缺点，因此需根据自身实验条件以及研究目标进行优化筛选方法的确定。
　　参考文献
　　[1] 窦全林，陈刚.纤维素酶的研究进展与应用前景[J].畜牧与饲料科学，2006，27（5）：58-60.
　　[2] 李西波，刘胜利.高产纤维素酶菌株的诱变选育和筛选[J].食品与生物技术学报，2006，25（6）：107-110.
　　[3] 李海伟，陈云琳.飞秒激光诱变微生物技术及其机理的研究进展[J].化工进展，2011，30（4）：824-829，847.
　　[4] 杨小冲，陈忠军.新型物理诱变技术在微生物育种中的应用进展[J].食品工业，2017，38（3）：242-245.
　　[5] 兰时乐，李立恒.微波诱变结合化学诱变选育纤维素酶高产菌的研究[J].微生物学杂志，2007，27（1）：22-25.
　　[6] 何钢，陈介南.酵母工程菌降解纤维素的研究进展[J].生物质化学工程，2006，40（B12）：173-177.
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