植物乳杆菌WD-1发酵树莓汁的代谢产物分析

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　　摘 要： 为了开发一种新型红树莓益生菌发酵饮料，本研究以从红树莓酵素中筛选出的优势菌株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum WD-1）为供试菌株进行红树莓果汁的发酵，测定了乳酸菌的发酵特性及其发酵后相关的代谢产物。结果显示，发酵后总酚含量和总黄酮含量比红树莓原果汁有较明显的降低，而总酸含量、有机酸和总氨基酸含量较发酵前都有显著升高。研究结果将为开发新型树莓发酵饮料提供了一定的理论和技术支持。
　　关键词： 红树莓;乳酸菌;植物乳杆菌;发酵;代谢产物
　　Analysis ofmetabolites
　　 in fermented raspberry juice by Lactobacillus plantarum WD-1
　　Zhao Nan1 Chang Manman2 Li Ying2 Yu Hongwei2 Guo Runfang2*
　　 1.Hebei Provincial Institute of Scientific and Technical Information HebeiShiJiazhuang 050021;
　　2.College of Food Science and Technology Hebei Agricultural University HebeiBaoding 071001
　　 Abstract： In this study，Lactobacillus plantarum WD-1，a dominant strain selected from the red raspberry Jiaosu.The fermentation characteristics of lactic acid bacteria and the changes of related metabolites after fermentation were studied.The results showed that the total phenol content and total flavonoid content were significantly lower than those of red raspberry fruit，while the content of total acid，organic acid and total amino acid was significantly increased.The results provide a theoretical basis and technical basis for the development new fermentation products.
　　Key words： red raspberry;lactic acid bacteria;Lactobacillus plantarum;fermentation;metabolite
　　红树莓（Red Raspberry）是蔷薇科树莓属浆果，是有着“红宝石”“黄金浆果”等美称的第三代水果[1]，富含氨基酸、维生素、糖类、矿物元素等丰富的营养成分[2]，除了上述的营养成分外，还含有很多对人体有较高的药用价值的功能性物质，如花青素、黄酮、鞣花酸、水杨酸、SOD（超氧化物歧化酶）、红树莓苷和红树莓酮[3-8]等功能性成分。充分挖掘和利用红树莓的营养价值开发新型加工产品，对红树莓产业的健康可持续发展有重要意义。
　　随着我国社会的发展和人民消费水平的提高，国内的饮料市场发生着翻天覆地的变化，人们对饮料的要求逐渐转向天然、营养和健康方向，而果蔬发酵是以蔬菜水果等为原料经多种益生菌发酵而产生，正好满足了消费者的需求。国内的研究者已就一些果蔬原料胡萝卜、南瓜、雪莲果、西瓜、花椰菜、香瓜、甜瓜、番茄[9]等进行了乳酸菌发酵研究，取得了初步的进展;国外亦然，尤其是日本，其果蔬饮料市场的发展趋势已经进入了良好轨道[9]。越来越多的研究表明果蔬发酵产品是一种有利用价值的微生物发酵产品，然而其发酵后的成分和功能特性主要取决于发酵液中的主要代谢产物的种类和数量[10]。然而目前对其发酵相关代谢产物的研究较少尤其关于树莓益生菌发酵的相关研究还是一个空白。因此本研究以红树莓果汁为原料，利用从红树莓酵素中筛选出的优势植物乳杆菌进行发酵，测定发酵前后的总酸、总酚、总黄酮、有机酸、氨基酸成分，为开发新型树莓发酵饮料提供一定的理论基础和技术依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　红树莓（Red Raspberry）：试验所用红树莓果均由河北至高点农业科技有限公司提供。
　　1.2 菌株与培养條件
　　植物乳杆菌WD-1（Lactobacillus plantarumWD-1），分离自树莓酵素中，保存于河北农业大学酶工程实验室。活化培养基为MRS肉汤培养基，37℃静置培养20h。
　　1.3 方法
　　1.3.1 红树莓汁的制备
　　挑选无霉无病的红树莓果实，用打浆机打浆，离心，过两层纱布，获得的红树莓汁采用巴氏灭菌（65～68℃，30min），保存备用。
　　1.3.2 红树莓汁的乳酸菌发酵培养
　　将已灭菌的红树莓汁置于无菌操作台上，取200mL装在已灭菌的500mL三角瓶中，再向瓶中按3%的接菌量加入乳酸菌菌悬液（108CFU/mL），37℃静置培养，每隔12h取样一次，并测定相应的理化和微生物指标。
　　1.3.3 总酸含量的测定
　　按照GB/T12456-2008《食品中总酸的测定》，采用pH电位法[11]，总酸度以乳酸计，每个样品重复3次。
　　1.3.4 总酚含量的测定 　　本试验采取Folin-Phenol法[12]测定总酚含量。以没食子酸为标准对照品，测定不同浓度没食子酸标准溶液在760 nm下的吸光度，以没食子酸溶液浓度（c）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准方程：y=11.42x+0.0281（R2=0.9996）。
　　准确称取已稀释40倍的样品溶液1mL，在760nm下测吸光度，以不加样品为空白对照，每个样品重复3次，利用标准曲线计算样品中的总酚含量。
　　1.3.5 总黄酮含量的测定
　　本试验采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[13]测定总黄酮含量。以芦丁为标准对照品，测定不同浓度芦丁标准溶液在510nm下的吸光度，以芦丁溶液浓度（c）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准方程：y=1.1171x+0.013（R2=0.9996）。
　　准确称取已稀释5倍的样品2mL，在510nm下测定样品的吸光度，以不加样品为空白对照，每个样品重复3次，利用标准曲线计算总黄酮的含量。
　　1.3.6 有机酸含量的测定
　　按照GB 5009.157—2016《食品中有机酸的测定》采用高效液相色谱检测法（HPLC）[14]来测定有机酸的含量，色谱条件为流动相：用0.1%磷酸溶液-甲醇=97.5+2.5（体积比）比例的流动性等度洗脱10min，然后用较短的时间梯度让甲醇达到100%并平衡5min，再将流动性调整为0.1%磷酸溶液-甲醇=97.5+2.5（体积比）的比例，平衡5min。流速1mL/min;柱温40℃;进样量20μL;检测波长210nm。
　　分别精密称取酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸对照品，用纯净水配制成0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL不同质量浓度的标准品储备液，再稀释制备成不同质量浓度的对照品溶液。以有机酸对照品质量浓度X对峰面积Y进行线性回归测定的有机酸标准曲线，见表1。
　　 取1mL已稀释5倍的样品，过0.45μm微孔滤膜，上机测定样品中有机酸含量，每个样品进样3次。并根据标线计算样品中有机酸含量。
　　1.3.7 氨基酸含量的测定
　　本研究采用反相高效液相色谱法，以2，4-二硝基氯苯（CDNB）作为柱前衍生试剂，对以乳酸菌发酵后的红树莓汁中的氨基酸进行含量分析[15]，色谱条件为：流动相A为乙腈;流动相B为乙酸-乙酸钠缓冲液（0.03mol/L乙酸钠溶液，加入0.15%三乙胺，再用冰乙酸调pH值为5.25±0.05）;流量1mL/min;柱温40℃;进样量10μL;检测波长360nm;参比波长为400nm。
　　分别称取适量的17种氨基酸的标准品，用0.1mol/LHCl定容于10mL容量瓶中，得到浓度均为500mg/L的混合标准溶液。将氨基酸混合标准液分别稀释为25、50、100、150、200、300、400、500mg/L的溶液，各标液取100μL依上述方法衍生后进行测定。以氨基酸对照品质量浓度X对峰面积Y进行线性回归测定的17种氨基酸标准曲线，见表2。
　　 样品中氨基酸含量的测定：精确称取1.00g的样品溶液于安瓿瓶中，加入6mol/L盐酸10.00mL，在110℃条件下水解14h，水解完成后离心水解液，取水解液上清1.00mL真空抽干，再加入0.1mol/L盐酸2.00mL溶解，备用。取100μL标准溶液或样品水解液于1.5mL离心管中，加入缓冲溶液（pH9.0）200μL、300mg/mL2，4-二硝基氯苯（乙腈溶解）100μL，漩涡混匀，于90℃恒温水浴锅中避光反应90min，反应结束后加入10%（v/v）乙酸50μL，调pH为中性，以水定容至1.00mL，混匀，取上清液过0.45μm微孔滤膜后，上机测定，每个样品进样3次，并根据标线计算样品中氨基酸含量。
　　2 结果与分析
　　2.1 发酵过程中的总酸含量
　　以pH电位法测定乳酸菌发酵红树莓汁过程中总酸含量的变化情况，结果见图1。
　　 由图1可以看出，红树莓汁的初始总酸含量约为74g/L，在发酵过程中随着发酵时间的延长，由乳酸菌发酵的红树莓汁的总酸含量一直呈上升趋势，即使在菌群生长的衰退期仍然可以继续利用红树莓汁中的糖分进行产酸，说明此株Lactobacillus plantarumWD-1具有较强的耐酸能力。
　　综上结果，我们选择48h为发酵终点来测定发酵后的总酚、总黄酮、有机酸、总氨基酸和挥发性有机物质。
　　2.2 发酵前后的总酚和总黄酮含量
　　对红树莓汁进行总酚和总黄酮含量的测定，以不接菌的红树莓汁为对照CK，结果见图2。
　　 由图2可以看出，以乳酸菌发酵48h后的总酚和总黄酮的含量较发酵前都有明显降低，在乳酸菌发酵过程中，红树莓中的酚类物质和黄酮类物质可能被乳酸菌分解利用，因此含量会降低。
　　2.3 发酵前后的有机酸含量
　　按照色譜条件和有机酸测定方法，对乳酸菌发酵后的红树莓汁进行HPLC含量分析，以不加菌的红树莓汁为对照CK，每个样品测定3次，结果见图3。
　　由图3可发现，经过乳酸菌发酵后供试的5种有机酸中，柠檬酸和乳酸含量显著增加。而其他的3种有机酸变化略有升高。
　　2.4 发酵前后样品中的氨基酸含量
　　图4可发现17种氨基酸对照品的HPLC图谱基本达到基线分离，峰形良好。
　　按照氨基酸测定方法，对乳酸菌发酵后的红树莓汁进行HPLC含量分析，以不加菌的红树莓汁为对照CK，每个样品测定3次，结果见表3。
　　对以乳酸菌发酵前后的红树莓汁氨基酸的含量进行分析比较，由表3可知，发酵前的氨基酸含量丰富，必需氨基酸种类齐全，Asp、Glu和Ala含量最高，TAA为3765.43mg/kg，EAA为642.93mg/kg;发酵后只检测到14种氨基酸，但必须氨基酸种类齐全，EAA与TAA较之前均有明显的升高，含量最高的也是Asp、Glu和Ala，这与红树莓的风味有关系，这三种氨基酸有可能为红树莓的呈味氨基酸。 　　3 结语
　　红树莓为原料的乳酸菌发酵饮料的总酚和总黄酮含量降低，而总酸、有机酸和总氨基酸含量较发酵前都有显著升高。因此，利用乳酸菌发酵红树莓汁从而开发出酸甜爽口且具有多种营养保健功能的益生菌发酵饮料，可作为一种技术含量高、原料转化利用率高、营养功能成分保护好、食品安全性高、生产操作方便、产品附加值高的果蔬深加工技术和产品，可以带动我国红树莓产业健康和良性发展，是红树莓深加工的技术延伸，有效延长新鲜果蔬的产业链，彻底解决一直以来制约我国红树莓深加工产业发展的瓶颈问题，也是社会经济发展和人们消费水平提高的重要标志。
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　　项目资助： 河北省重点研发计划（17227117D-03）;河北省教育厅重点项目（ZD2017040）
　　作者简介： 赵男（1984—），女，汉族，河北石家庄人，硕士，工程师，研究方向：食品安全。
　　*通讯作者： 郭润芳（1969—），女，汉族，河北张家口人，博士，教授，研究方向：食品生物技术。
　　

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