杜仲内生真菌发酵产物多糖的体外细胞毒活性筛选
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摘 要：目的 该文对从杜仲内生真菌发酵产生的多糖成分进行体外细胞毒活性筛选。方法 采用MTT法，用杜仲内生真菌多糖对7种肿瘤细胞进行体外细胞毒实验。结果 实验结果发现，杜仲内生真菌发酵产物中的多糖成分对HL-7702和Hela肿瘤细胞的IC50值分别为17.493.91和9.5216.24。结论 实验结果表明杜仲内生真菌发酵产物杜仲多糖对部分肿瘤细胞具有一定的细胞毒作用。
关键词：杜仲 内生真菌 抑菌作用
中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2019）12（c）-0156-02
植物内生菌代谢产物丰富多样，活性作用也不尽相同，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、杀虫和免疫抑制等生物活性，有一些内生菌还能产生活性物质，与宿主植物药用成分相同。所以，在活性物质筛选和新药研发方面，内生菌具有无穷潜力[1]。2003年，李雅等人[2]最早开始了对杜仲内生菌的研究，他们采用WA-抗生素培养基和PDA培养基，从采自陕西杨凌的杜仲各个组织中分离到了49株内生真菌。然后，用苹果腐烂病菌（Cyt-osporasp）作为致病菌株，对分离到的这49株内生真菌进行了抗菌活性测定，结果发现，有22株菌株对至少3种致病菌有显著的抑制作用。Chen等人[3]研究发现，对从四川成都杜仲叶和树皮中分离得到的29株内生真菌进行抗菌活性筛选后，发现大部分内生真菌都可以抑制供试病原细菌，但是抑制供试病原真菌的效果不太显著。丁婷等人[4]研究发现，从杜仲中分离出32株内生真菌中，属于梭孢壳属的内生真菌DGS08对玉米纹枯病菌的生长有很好的抑制作用。该文对筛选出得杜仲内生真菌代谢产物多糖进行抗肿瘤活性筛选。
1 材料
1.1 试剂
青链霉素混合液（Solarbio），DMEM高糖培养基（Gibco），优级胎牛血清（tbd science），二甲基亚砜（DMSO）（天津市富宇精细化工有限公司），四甲基噻唑蓝（MTT）（Sigma）;胰蛋白酶（Trypsin）美国Amresco公司。
1.2 细胞株
MCF-7（人乳腺癌细胞株），K562（人慢性髓系白血病），HeLa（人宫颈癌），A549（肺腺癌细胞株），SMMC-7721（人肝癌细胞），HepG-2（人肝癌细胞系），MDA-MB-231（人高转移性恶性乳腺癌细胞）：南京凯基生物技术股份有限公司。
HL-7702（正常人肝细胞）：中国科学院上海细胞库。
1.3 仪器
500-831型全长酶标仪（Thermo Fisher Scientific），2424-2型CO2培养箱（上海科瑞生物技术有限公司），TDL-50B型低速台式离心机（舜宇仪器有限公司），JJ-CJ-2FD超净化工作台（吴江市净化设备总厂产品）。
2 实验方法
2.1 细胞的培养
将MCF-7、SMMC-7721、MDA-MB-231、K562、HL-7702、HeLa、HepG-2、A549在37℃，5%CO2条件下用含10%胎牛血清、青霉素1×105U/L及链霉素100mg/L的DMEM培养基培养至细胞对数期。
2.2 MTT法检测细胞活性
取对数生长期的各个细胞株按4×105/孔接种到96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养24h后设置正常组（不加化合物），实验组（100mg/mL、50L、5、1、0.5mg/mL）分别加到96孔板中，每个浓度设置6个平行复孔，继续孵育48h后，在避光条件下每孔给予10μLMTT（5mg/mL），繼续放置于37℃、5%CO2培养箱中培养，4h后，弃去上清液，每孔加入100μL的DMSO（分析纯）溶液，放置于室温条件下，100rpm的震荡箱下震荡10min直至MTT反应的蓝色结晶产物完全溶解，置于多功能酶标仪中，设置570nm的波长下检测吸光度（Optical Density，OD），读出OD值带入公式中，求得细胞抑制率，并计算IC50值。实验重复3次。
细胞抑制率%=（1-实验组OD值/正常组OD值）×100%
3 实验结果
由表1可知：杜仲多糖对MCF-7、SMMC-7721、MDA-MB-231、K562、HL-7702、HepG-2细胞作用48h后，对细胞没有明显的抑制率（P>0.05），从表中可以看出杜仲多糖对HeLa，A549细胞有明显的抑制率（P<0.05），IC50值分别为17.49±3.91和9.521±6.24。
由图1可知，不同浓度的杜仲多糖对A549细胞的生长均有一定的抑制作用。当杜仲多糖对A549细胞作用48h，浓度在0.5～5mg/mL抑制率波动不明显，但有显著性差异（P<0.01），随着多糖浓度的增加，浓度在50mg/mL时对细胞的抑制率明显增强（P<0.01），而且50mg/mL的时候抑制率为80%，达到一个平台期，浓度在100mg/mL时抑制率为78%。
4 讨论
在观察杜仲多糖对细胞增殖的抑制作用时，我们首先采用MTT法来进行实验，以筛选杜仲多糖有效作用浓度范围及IC50，然后采用MTT法测定各实验组细胞的生长抑制率。杜仲多糖各组作用HeLa，A549细胞后，其生长均受到了显著的抑制。随着浓度的升高，抑制率也不断升高，说明药物的作用具有浓度依赖性。
近年来多糖类的抗肿瘤作用引起了人们广泛的注意，除可通过增强宿主免疫功能而发挥抗肿瘤作用外，多糖还能通过诱导肿瘤细胞凋亡等途径直接杀伤肿瘤细胞，从辛晓明的报道中可以看出杜仲总多糖具有显著的肿瘤抑制作用，并能够提高胸腺指数、脾指数、外周血白细胞计数和骨髓有核细胞计数，增强宿主免疫功能而发挥抗肿瘤作用。
参考文献
[1] 曾松荣，徐成东，王海坤，等.药用植物内生真菌及其具宿主相同活性成分的机制初探[J].中草药，2000，31（4）：306-308.
[2] 李雅，宋晓斌，马养民，等.杜仲内生真菌对植物病原真菌的抑菌活性研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2007，35（2）：69-73.
[3] Chen XM， Sang YX， Li SH， et al. Studies on a chlorogenic acid-producing endophytic fungi isolated from Eucommia ulmoides Oliver [J].J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37（5）：447.
[4] 丁婷，孙微微，韩亚惠，等.杜仲内生真菌DZJ07在小麦根际定殖及对根部酶活的影响[J].核农学报，2015，29（6）：1149-1157.
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