女贞子体外抗氧化活性有效部位制备和筛选
来源:用户上传
作者:
摘 要：目的：制备和筛选女贞子的抗氧化活性有效部位。方法：用乙酸乙酯萃取，柱层析和大孔树脂分离技术，分为不同部分，并进行DPPH·自由基的清除能力测试，评价各部抗氧化活性。结果：每个部位都不同程度具有抗氧化活性，石油醚萃取部分B活性最低，从乙酸乙酯得到的H部分抗氧化活性最高。结论：抗氧化活性最高的化合物存在于H部分。
关键词：女贞子;DPPH;抗氧化;有效部位
女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实，具有养阴气、平肝火、健腰膝、壮筋骨、滋补肝肾、乌须发等功效。现代医学研究证明许多慢性疾病都与人体内累积过多的氧自由基有关，从中药中寻找具有抗氧化的活性成分是一条相对安全的途径，近年研究发现女贞子及其化学成分具有较强的抗氧化活性。
本实验为筛选女贞子抗氧化活性部位，应用溶剂提取法和萃取法、硅胶柱色谱法、大孔吸附树脂分为12个部位A～L，通过DPPH·自由基的清除能力测试各个部位抗氧化能力，以期从中筛选出抗氧化的活性部位，为女贞子深度开发和新药研究提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
女贞子药材采自四川绵阳四川中医药高等专科学校校内（样品保存于四川中医药高等专科学校药物化学实验室内，编号NZZ2012）。
1.2 方法
1.2.1 DPPH·自由基的清除能力测试方法
取适量样品溶于95%乙醇，配制成1mg·mL-1的溶液。准确称取20mg DPPH，溶于95%乙醇并定容于250mL容量瓶中，配制成浓度为2×10-4mol·L-1DPPH的标准溶液，4℃保存备用。往10mL比色管中依次加入4 mL pH6.86标准混合磷酸盐缓冲液、4mL 2×10-4mol·L-1的DPPH溶液，摇匀。再加入1mL浓度为1mg·mL-1的样品溶液，用蒸馏水补充体积至10.00mL 刻度，充分混匀，10min后用95%乙醇作参比在520nm处测定其吸光度。按照以下公式计算样品对DPPH·自由基的清除率：
式中，Ai为加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度;Aj为不加DPPH，只加抗氧化剂及水的溶液的吸光度;Ac为不加抗氧化剂，只加D P P H及水的溶液的吸光度。
1.2.2 女贞子的粗提和DPPH·自由基的清除能力测试
取女贞子8.7kg粉碎，过1号筛，等体积甲醇浸提（48小时）3次，合并提取液。60℃减压浓缩得浸膏（A）1.8kg。取适量甲醇提取物（A）溶于95%乙醇，配制成1mg·mL-1的溶液。按照1.2.1项方法测试抗氧化活性，其浓度为0.1mg·mL-1时，DPPH·自由基的清除率为46.20%。
1.2.3 女贞子提取物的萃取分离和DPPH·自由基的清除能力测试
浸膏用水混悬，分别用等体积石油醚（60～90℃）、等体积乙酸乙酯和等体积正丁醇依次萃取三次，60℃减压浓缩分别得到110g石油醚萃取物（B）、325 g 乙酸乙酯萃取物（C）、613g正丁醇萃取物（D）和730g水溶性成分（E）。
石油醚萃取物的DPPH·自由基的清除率为11.49%，乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余水溶性成分的DPPH·自由基的清除率分别为69.28%，62.97%，58.61%。由此可见通过萃取方法分离，乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余水溶性成分的抗氧化活性最高，乙酸乙酯萃取物相对于甲醇提取物46.20%的清除率，活性提高近百分之五十。
1.2.4 乙酸乙酯萃取物分离和DPPH·自由基的清除能力测试
将乙酸乙酯萃取物加热溶于无水乙醇，静置析出沉淀，过滤并用无水乙醇洗涤得F，200g。剩余部分约90克拌样上硅胶（100-200目，1kg）柱，氯仿-甲醇梯度洗脱得G，H，I部分。G，H，I部的DPPH·自由基的清除率分别为19.48%，62.80%，71.98%，65.22%。
1.2.5正丁醇萃取物分离和DPPH·自由基的清除能力测试
将正丁醇萃取物溶于适量水中，用预处理好的D101大孔树脂0.75kg室温吸附24小时，最后完全吸附。分别用水，40%乙醇和无水乙醇洗脱，得到J，K和L部位的DPPH·自由基的清除率分别为66.54%，66.35%，35.47%。
2 结果
测试结果显示，通过萃取、层析等方法得到的女贞子各个部位均具有抗氧化活性。其中通过分离纯化后G，H，I，J，K部分的DPPH·自由基的清除率均大于62.00%，抗氧化活性相对于甲醇粗提物A活性提高了近50%。而等浓度（0.1mg·mL-1）的维生素C，没食子酸和綠茶多酚的DPPH·自由基的清除率分别为19.96%，65.54%，53.42%，可见G，H，I，J，K部位具有显著的抗氧化活性。F部位的抗氧化活性虽然只有19.48%，但其总含量大，占乙酸乙酯萃取物部分的62%。女贞子的醇提物有显著的抗氧化活性，通过萃取得到的乙酸乙酯部分和正丁醇部分抗氧化活性显著。其中乙酸乙酯部分三萜含量最高，含量可达60%，虽然三萜类抗氧化活性相对较低，但由于量大，在女贞子整体抗氧化中有一定作用。乙酸乙酯萃取物的G，H，I部分抗氧化活性显著，比等浓度（0.1mg·mL-1）的维生素C，没食子酸和绿茶多酚强，其中部位H的 DPPH·自由基的清除率高达71.98%。G，H，I部分主要是黄酮类成分，但占提取物的比例较小。正丁醇萃取部纯化部分J，K（0.1mg·mL-1）的 DPPH·自由基的清除率均大于66%，同样比等浓度（0.1mg·mL-1）的维生素C，没食子酸和绿茶多酚强。
3 讨论
女贞子在我国分布广泛，资源丰富，主要含有三萜类化合物、黄酮类、裂环环烯醚萜类和对羟基苯乙醇苷类化合物。
通过分离筛选得到的几个有效部位都有较强的抗氧化活性，强于同浓度的维生素C，没食子酸和绿茶多酚，为女贞子抗氧化活性成分的研究和深度开发研究提供了参考依据。其中黄酮类化合物部分H抗氧化活性最强，我们将继续研究，希望从中分离得到抗氧化活性较强的单体或其组合物。
基金项目：四川中医药高等专科学校项目基金：女贞子抗氧化活性部位制备工艺研究（16ZRYB04），女贞子抗衰老研究（17ZRYB03）
作者简介：江洪波（1976-），男，副教授，主要从事中药活性成分研究工作。
通讯作者：张志强，研究方向：中药活性成分研究。
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15112686.htm
