16种含马兜铃内酰胺衍生物类中药甲醇提取物对家蝇和埃及伊蚊活性筛选

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　　摘  要  寻找和开发安全有效的植物性杀虫剂，以丰富植物源农药的来源，填补化学农药禁限用留下的空白。甲醇冷浸提取法制备辽细辛、石楠藤、金狮藤等16种中草药的提取物，采用无限量取食法，测定了对家蝇成虫的活性，采用幼虫浸液法，测定了对埃及伊蚊四龄幼虫的活性。结果表明：在10 mg/mL浓度下，处理家蝇48 h后，辽细辛、石楠藤、金狮藤、单叶细辛校正死亡率分别为100%、100%、100%和98.33%，LC50值分别为0.1483、0.1544、3.5277和2.4292 mg/mL，三叶鱼藤LC50值为0.9080 mg/mL;在0.5 mg/mL浓度下处理埃及伊蚊四龄幼虫48 h，辽细辛、石楠藤、金狮藤、单叶细辛、厚朴校正死亡率分别为100%、100%、100%、100%和100%，LC50值分别为0.0046、0.0094、0.0570、0.0658和0.0504 mg/mL，三叶鱼藤为0.1194 mg/mL。辽细辛、石楠藤、单叶细辛、金狮藤对两种试虫均表现出优良的杀虫活性，均优于或接近三叶鱼藤活性。
　　关键词  马兜铃酸;马兜铃内酰胺;杀虫活性;家蝇;埃及伊蚊
　　中图分类号  S482.3      文献标识码  A
　　Abstract  In order to find and develop safe and effective botanical insecticides， to enrich the sources of botanical pesticides and fill the gaps left by prohibitions and restrictions on the use of chemical pesticides， sixteen kinds of Chinese herbal medicines were extracted by methanol， and the insecticidal activity against adult Musca domestica was tested by the method of unlimited intake， and that against the fourth instar larvae of Aedes aegypti was tested by the larval immersion method. The results showed that after 48 h treatment at 10 mg/mL， the corrected mortality rates of Asarum heterotropoides F. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.） Kitag， Piper wallichii （Miq.） Hand-Mazz， Aristolochia kaempferi Willd. [A.mollis Dunn]， Asarum himalaicum Hook. f. et Thoms. ex Klotzsch was 100%， 100%， 100% and 98.33%， respectively， and the LC50 value separately was 0.1483， 0.1544， 3.5277 and 2.4292 mg/mL， while that for Derris trifoliata Lour was 0.9080 mg/mL. Against the 4th instar larvae of A. aegypti at 0.5 mg/mL for 48 h， the corrected mortality rate of A. heterotropoides， P. wallichii， A. kaempferi， A. himalaicum， and Magnolia officinalis Rehd. et Wils. was 100%， 100%， 100%， 100% and 100%， separately， and the LC50 value was 0.0046， 0.0094， 0.0570， 0.0658 and 0.0504 mg/mL， respectively， while that for D. trifoliata Lour was 0.1194 mg/mL. A. heterotropoides， P. wallichii， A. kaempferi， A. himalaicum showed excellent insecticidal activity on the two tested insects， better than or close to the activity of the control D. trifoliata.
　　Keywords  aristolochic acid; aristololactam; insecticidal activity; Musca domestica; Aedes aegypti
　　DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.024
　　近年來，世界各国在不断地加强对高毒高残留农药的管理力度，农药壁垒在国际农产品市场即将全面形成，不仅严重冲击发展中国家的农药生产和出口，而且把使用了高毒高残留农药的农产品拒之于世界主要市场之外，因此，在作物上使用更加安全的生物农药来代替化学农药已经成为当务之急。植物源农药是生物农药的重要组成部分，具有低残留、对环境无污染，选择性高、对非靶标生物相对安全，开发成本低廉、易和其他农药混配等优点，成为近几年开发利用的一个热点。 　　马兜铃内酰胺衍生物类化合物包括马兜铃内酰胺或马兜铃酸及其硝基菲类有机酸衍生物成分，主要存在于马兜铃酸科马兜铃酸属（Arisrolochia）、细辛属（Asarum）、木通科木通属（Akebia）、毛莨科铁线莲属（Clematis）、防己科千金藤属（Stephania）、蝙蝠葛属（Menispernum）、菊科川木通属（Vladimiria）等几十种植物中[1]，分布在热带和亚热带地区，温带地区有少数分布[2]。马兜铃酸、马兜铃内酰胺药理作用广泛，有抗感染、镇痛、疏通心血管的药理作用、抗癌、增强细胞免疫、终止妊娠及减肥等功能[3-4]。长期以来，含有马兜铃酸的中药材被广泛应用于消化系统、泌尿系统、呼吸系统、心血管系统等多种疾病的治疗[5]。但是，1993年比利时学者Vanherweghen等[6]报道了服用含广防己的减肥药出现急性肾间质纤维化、慢性进行性肾功能不全的病例。近些年，随着大量的临床报道和实验研究，马兜铃酸的肾毒性和其他毒性作用陆续被发现，美国食品药品管理局也在2000年5月相继发布了2个有关含有马兜铃酸植物药物和食品的通告，对进口的相关草药和制剂进行限制[5]。2017年10月18日，来自新加坡和中国台湾的研究人员在Science子刊Science Translational Medicine发布了关于在中国台湾和整个亚洲地区马兜铃酸及其衍生物的使用和肝癌发生密切相关的研究论文[7-8]。因此很多西方国家已全面禁止含有马兜铃酸（AAs）的中药出售。中国国家食品药品监督管理局也取消了相关药物如关木通、广防己、青木香等中药的药用标准[9]。很多相关中草药已经禁止或限制在中药中使用，作者考虑到很多这类中药都有一定毒性，为了扩大这些中药的用途，探讨其在农药方面开发利用，对含有马兜铃内酰胺和马兜铃酸的中药进行杀虫活性筛选，以期找到新的植物源杀虫植物，最终找到新的农药前体化合物。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  植物样品  中药材样品均购买自安徽毫州皖北赵氏药业，经中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所王清隆鉴定17种中药材样品（表1），其中一种为经典对照杀虫植物三叶鱼藤，标本储存于海南大学热带农林学院天然源农药研究实验室。
　　1.1.2  供试昆虫  家蝇（Musca domestica Linaeus）由天然源农药实验室饲养;埃及伊蚊（Aedes aegypti）供试虫种为本实验室饲养的敏感品系，由海南大学热带农林学院动系韩谦教授实验室提供。
　　1.1.3  主要仪器与试剂  EYELA（N-1100）旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社;20 L Laborata 4001型旋转蒸发仪，德国Heidolph公司;FED400烘箱，德国Binder公司;ME104型电子天平，瑞士Mettler Toledo公司。所用试剂工业甲醇、二甲基亚砜等均为分析纯，为广州化学试剂厂生产。
　　1.2  方法
　　1.2.1  浸膏的提取  采用冷浸提法，将采购的中药材分别置于电热恒温鼓风干燥箱中，控温（50±2）℃烘干，经粉碎机粉碎，甲醇浸泡提取，反复3次，滤液在60 ℃减压蒸馏浓缩，即得到甲醇初提取浸膏，合并3次浸提膏，置于4 ℃冰箱内保存备用。
　　1.2.2  试虫饲养  家蝇和埃及伊蚊的饲养方法参考董存柱等[10]研究中的方法。
　　1.2.3  对家蝇活性筛选  经过前期预实验，确定10 mg/mL为家蝇活性筛选浓度。称取3.00 g蔗糖置于透明一次性杯子中（口直径6.00 cm，底直径4.00 cm，高8.50 cm）备用，每种称取提物浸膏0.15 g放入25 mL烧杯中，加入10 mL丙酮使其充分溶解，定容至15 mL，最终浓度为10 mg/mL。移液枪移取3 mL配制好的药液于杯中，每个浓度设3个重复，空白对照组用丙酮处理后置于风扇下吹12 h，使丙酮挥发完全。三角瓶抓取家蝇，纱布蒙口，将乙醚湿润的棉花置于瓶口，麻醉后迅速计数20只家蝇放入杯中，纱布封口，纱布外放一润湿棉花球供水。观察记录6、48 h家蝇的死亡数，统计死亡率。
　　1.2.4  对埃及伊蚊活性筛选  经前期预实验确定0.5 mg/mL为活性筛选浓度。提取物药液的配制：分别称取0.1 g浸膏置于烧杯，加2 mL二甲基亚砜助溶，搅拌溶解后加脱氯水定容至200 mL备用;等量溶剂加入脱氯水作为对照。
　　杀虫活性的测定：向一次性杯子（参数同1.2.3）中移入20 mL配好的药液，每处理重复3次，每重复滴管吸取20只饲养5 d的大小均一、发育一致的埃及伊蚊幼虫。死亡标准：虫体僵直、尾部明显变黑，浮于药液上或沉于底部。于6、48 h统计结果，记录死亡数并计算埃及伊蚊幼虫校正死亡率。
　　1.2.5  高活性提取物对家蝇的LC50  取初筛活性明显的4种中草药（辽细辛、石楠藤、单叶细辛、金狮藤）和对照三叶鱼藤根甲醇提取物进行毒力测定。溶液浓度配制：辽细辛、石楠藤各取0.018 g，单叶细辛、金狮藤各0.36 g，每种药分别放入50 mL烧杯中，对应加入45 mL丙酮，得到母溶液，据公式C1×V1= C2×V2梯度配制其余濃度，最终配制得到辽细辛和石楠藤浓度分别为0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15 mg/mL，金狮藤和单叶细辛为8、7、6、5、4、3、2 mg/mL。三叶鱼藤根甲醇提取物梯度稀释至浓度为10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL，测定方法同1.2.3，48 h后统计结果。
　　家蝇死亡标准：家蝇被击倒，虫体出现失水现象，触角不动，或六足、口器、翅微颤[11]。 　　1.2.6  高活性提取物对埃及伊蚊的LC50  根据筛选结果确定5种提取物进行毒力测定，金狮藤：称取0.2 g金狮藤浸膏提取物，加2 mL二甲基亚砜助溶，以脱氯水定容至200 mL为母液，其母液质量浓度为1 mg/mL，取母液18 mL加82 mL脱氯水定容100 mL，得到0.18 mg/mL的质量浓度，最终配制成质量浓度分别为0.18、0.15、0.12、0.09、0.06 mg/mL的药液;单叶细辛和厚朴的配制同金狮藤，最终得到0.15、0.12、0.09、0.06、0.03 mg/mL 5个质量浓度;辽细辛：取0.05 g浸膏提取物，加2 mL二甲基亚砜溶解，加脱氯水定容至1000 mL，方法同金狮藤配制方法，最终得到0.017、0.014、0.011、0.008、0.005 mg/mL 5个质量浓度;石楠藤的配制同辽细辛，最终得到质量浓度分别为0.02、0.017、0.014、0.011、0.008 mg/mL，三叶鱼藤根浸膏最终配制浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL，等量二甲基亚砜加入脱氯水作为对照。
　　处理方法同1.2.4，于处理后6、48 h观察、记录死亡虫数、测定LC50。
　　1.3  数据处理
　　死亡率和校正死亡率计算方法如下：
　　采用DPS v9.50软件统计分析不同处理间的差异显著性（Duncan’s新复极差测定法），毒力测定分析采用毒力回归方法[11]。
　　2 结果与分析
　　2.1  中药甲醇提取物对家蝇和埃及伊蚊活性筛选
　　从表2可以看出含马兜铃酸和马兜铃内酰胺类中药甲醇提取物，在处理6 h后辽细辛、石楠藤、金狮藤、单叶细辛对家蝇和埃及伊蚊均表现良好杀虫活性及速效性，家蝇校正死亡率分别为100%、100%、71.67%、63.33%，埃及伊蚊为100%、100%、96.67%、100%，厚朴、关木通和鼻血雷仅表现对埃及伊蚊良好杀虫活性及速效性，校正死亡率分别为96.67%、48.33%、70.00%。
　　在处理48 h后，辽细辛、石楠藤、金狮藤、单叶细辛对家蝇活性4者之间差异不显著，均表现优良杀灭活性，校正死亡率分别为100%、100%、100%、98.33%，青木香、厚朴、鼻血雷表现一定杀家蝇活性，校正死亡率分别为36.67%、23.33%、31.67%;辽细辛、石楠藤、金狮藤、单叶细辛、厚朴、关木通、鼻血雷、背蛇生均表现优良的对埃及伊蚊的杀灭活性，校正死亡率分别为100%、100%、100%、100%、100%、86.67%、96.67%、95.00%，马兜铃和青木香表现一定杀埃及伊蚊活性，校正死亡率分别为31.67%、23.33%。辽细辛、石楠藤、金狮藤、单叶细辛对2种试虫均表现出优良杀虫活性。
　　2.2  高活性中药甲醇提取物对家蝇和埃及伊蚊的LC50
　　由表3可以看出辽细辛、石楠藤甲醇提取物在处理48 h后对家蝇有优良的杀虫活性，LC50分别为0.1483、0.1544 mg/mL，优于对照三叶鱼藤提取物的0.9080 mg/mL，单叶细辛、金狮藤、杀家蝇活性接近对照三叶鱼藤LC50分别为2.4292、3.5277 mg/mL，也表现较好杀虫活性。
　　辽细辛、石楠藤、单叶细辛、金狮藤、厚朴甲醇提取物对埃及伊蚊均表现优良杀虫活性LC50分别为0.0046、0.0094、0.0658、0.0570、0.0504 mg/mL，优于对照三叶鱼藤提取物的0.1194 mg/mL。
　　辽细辛、石楠藤、单叶细辛、金狮藤对家蝇和埃及伊蚊两种试虫都表现出较好杀虫活性。
　　3  讨论
　　在筛选的16种中药中，辽细辛、石楠藤、单叶细辛、金狮藤、厚朴有良好杀虫活性，莫建初等[12]曾报道细辛对黄胸散白蚁的毒效，证明华细辛（Ascrum sieboldii）粉对黄胸散白蚁（Reticulitermes speratus）具有较强的毒杀效果和驱避活性，韩俊艳[13]报道了北细辛挥发油对二斑叶螨（Tetranychus urticae Koch）的熏蒸毒性和北细辛甲醇提取物对二斑叶螨雌成螨和卵的触杀活性，杨银书等[14]研究了细辛挥发油对草原革蜱（Dermacentor nuttallii）、日本血蜱（Haemaphysalis japonica）、青海血蜱（H. qinghaiesis）成虫、血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineous）成虫等具有较好的麻痹及驱避作用，王桂清等[15]测定了细辛精油对淡色库蚊（Culex pipiens pallens Coq.）幼虫的毒杀作用和对成虫的熏蒸、触杀作用，结果表明，细辛精油对淡色库蚊幼虫有较强的毒杀作用，杨秀娟等[16]报道华细辛叶的水提取液对南方根结线虫（Mefoldogyne incognila）二龄幼虫的杀虫效果（24 h）为100%，张启东[17]最早报道了厚朴对桃蚜和山楂叶螨的杀虫活性，华细辛和北细辛有较多杀虫活性方面的报道，其他筛选含类似成分中药除厚朴外没有杀虫活性相关报道。
　　关于马兜铃酸的活性报道集中在人的肾毒毒性报道[5]，这类化合物和含这类化合物中药中分离出化合物的杀虫活性报道还比较少，如本课题组马浩伟等从北马兜铃中分离到马兜铃内酰胺W、马兜铃内酰胺X、马兜铃内酰胺Y、N-羟基马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、9-甲氧基马兜铃内酰胺Ⅰ六个化合物，其中N-羟基马兜铃内酰胺Ⅰ表现出较强的对埃及伊蚊四龄幼虫的杀虫活性，其LC50值为3.54 μg/mL[18]，作者测试辽细辛和石楠藤的甲醇提取物的杀埃及伊蚊活性的LC50分别为0.0046、0.0094 mg/mL，与北马兜铃高活性化合物活性相当;Venkatraman等[19]从Aristolochia indica Linn.分离得到马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ，对malaria mosquito 四龄幼虫有较强的杀虫活性，其LC50值分别为0.5023和0.5432 mg/mL，而辽细辛、石楠藤、单叶细辛、金狮藤、厚朴对埃及伊蚊四龄幼虫活性的LC50分别为0.0046、0.0094、0.0658、0.0570、0.0504 mg/mL，均明显好于以上马兜铃酸的杀虫活性，虽然试虫稍有不同，但作者筛选的均为中药的甲醇粗提取物，其中所含活性成分的含量相对纯化合物较低，推测如果是纯化合物，其活性会更高;Gisele等[20]從Aristolochia malmeana根部分离出的（–）-kusunokinin对黎豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）杀虫活性达到LD10 = 9.3、LD50 = 230.1 ?g/?L;Nascimento等[21]从Aristolochia pubescens分离出的马兜铃酸和ent-kaur-15-en-17-ol能显著延长黎豆夜蛾（A. gemmatalis）的幼虫期，（+）-eudesmin和（+）-sesamin能够造成其成虫畸形，也证明这类中药具有杀虫活性。 　　本文采用家蝇、埃及伊蚊等这些卫生害虫作为试虫，主要出于方便建立准确药效测定评价标准方面的考虑，这些中药植物的杀虫谱还应对更多的测试对象，特别是农业害虫进行研究。本研究采用胃毒和水浸渍的方法，未使用农药助剂，但对于植物源农药的应用，应该采用助剂使其更易到达靶标来增加渗透和延展能力，以利充分发挥药效。综上所述，这些中药材具有较高杀虫活性，但还没有相关文献开展系统研究，有必要对其化合物进行进一步的研究。另外防蚊幼虫产品偏少、品种有限、发展缓慢，我国与国际上的情况类似，其产品仅占卫生用农药总量的1.7%，而这类产品在推动病媒生物综合防治“三部曲”（即清洁、杀幼、防蚊）中起到重要的先遣防蚊作用[22]。而这类部分中药优良的杀蚊幼虫特点，可以考虑加工出相关剂型，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、缓释模块剂等在水中施药来防治水中幼虫;其中缓释模块剂型直接用于外环境水体防治蚊幼虫，是能够适当控制释放有效成分速度的固体制剂，具有较长的防治有效期和环保性。所以这类中药开发杀虫活性的应用研究和开展活性先导化合物的研究，应具有广阔的前景。
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