龙须藤茎皮甲醇提取物生物活性初探

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　　摘要 龙须藤Bauhinia championii在医用方面已证实具有良好的抗菌、消炎作用，但其在农用方面的活性研究还鲜有报道。本研究分别采用菌丝生长速率法和种子生物测定法，首次测定龙须藤茎皮甲醇提取物及分离组分对6种农业有害真菌和单、双子叶两种植物的生物活性。结果表明，龙须藤甲醇浸提物对水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae有一定的抑制效果，对油菜Brassica napus和稗草Echinochloa crusgalli的根芽均没有抑制作用。但其甲醇浸提物中分离的大部分组分对供试病原菌和植物的根芽都表现出一定抑制作用。杀菌活性方面：10号组分对西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum和番茄早疫病菌Alternaria solani的抑制效果最好，抑制率分别达到80.0%和78.0%，除草活性方面：1～3号组分对油菜根的抑制率较高，达到50%以上，2号组分对稗草根的抑制效果最好，达到68%。可见，龙须藤茎皮提取物中含有具有良好杀菌活性和除草活性的物质。
　　关键词 龙须藤; 提取物; 生物活性; 植物源农药
　　中图分类号： S 482
　　文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018236
　　Abstract Bauhinia championii has excellent antibacterial， antiinflammatory and other medical effects， but few studies have been reported on its agricultural biological activities. In this study， mycelia growth rate and seed bioassay methods were used to determine the bioactivities of the methanol extracts and separated components from B. championii against six species of agricultural pathogenic fungi and two weeds. The results showed that the methanol extracts had moderate inhibitory activity against Magnaporthe oryzae， and had no inhibitory effects on the root and buds of Brassica napus and Echinochloa crusgalli. However， some of the components isolated from the methanol extracts showed moderate inhibition against the tested pathogens， and the roots and buds of tested plants. In particular， component 10 showed the best inhibitory effect against Fusarium oxysporum and Alternaria solani， with an inhibition rate of 80.0% and 78.0%， respectively. The components 1-3 showed more than 50% inhibition rate against the root of B. napus. The component 2 had the best inhibitory activity against E. crusgalli， reaching 68%. The results provided a new idea for the development of new botanical pesticides.
　　Key words Bauhinia championii; extracts; biological activity; botanical pesticide
　　龍须藤Bauhinia championii是豆科苏木亚科羊蹄甲属有花植物。分布于越南、印度尼西亚、印度以及中国的广东、湖南、湖北、江西、福建、浙江、贵州、广西、台湾等地，生长于海拔200～1 000 m的地区，一般生于丘陵灌丛、山地疏林以及密林中，尚未人工引种栽培。福建福州永泰县青云山地区龙须藤资源丰富[1]。龙须藤性平、苦涩，无毒，主要含有黄酮类[25]、多糖[1，6]、挥发油[7]等，具有抗炎镇痛[810]、消除自由基[1112]、抗菌[13]、抗肿瘤[14]等功效，在畲医中作为一种治疗痹症的特效药[15]，常用于治疗风湿疼痛。龙须藤农用生物活性方面的研究还鲜有报道。在减肥减药不减产的农业大背景下，植物源农药因其对人畜安全、环境相容性好、低残留等优点而备受人们的重视与青睐[1617]。本研究对龙须藤茎皮进行甲醇冷浸提取，提取物采用硅胶柱层析进行初步分离，并检测了甲醇浸提物及分离组分的农用杀菌和除草活性，旨在为植物病害和草害的防治及新植物源农药的研究与开发提供新思路。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试植物
　　2017年2月于广西贺州市信都镇联盟村民黎山采集的新鲜龙须藤，由中国科学院武汉植物园江明喜研究员鉴定为豆科羊蹄甲属植物龙须藤Bauhinia championii。
　　1.2 供试种子和菌种
　　油菜Brassica napus和稗草Echinochloa crusgalli种子由长江大学农药研究所提供;西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum、番茄早疫病菌Alternaria solani、水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、白芨白绢病菌Sclerotium rolfsii、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum等病原菌菌种由长江大学农学院植物保护教研组提供。 　　1.3 主要仪器及供试药剂
　　FA2004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司;SWCJ2FD型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;QT型超声波清洗器，天津市瑞普电子仪器公司;DLF18型流水式中药粉碎机，温州顶历医疗器械有限公司;RE5205型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;ZFⅠ型三用紫外分析仪，上海顾村电光仪器厂;ES315型高压灭菌锅，Tomy Kogyo Co.，Ltd;SPX250型生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司;BIC400型人工气候箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;200～300目硅胶，青岛谱科分离材料有限公司。石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮和吐温80均购自天津天力化学试剂有限公司。
　　1.4 龙须藤茎皮甲醇提取物的制备
　　参照姚宗理等的提取方法[18]，对新鲜的龙须藤茎皮进行脱落处理，于室内晾至近干，40℃烘至恒重，用中药粉碎机粉碎，过60目标准筛。取250.00 g茎皮粉末，用5倍体积的90%甲醇室温浸提5次，每次48 h，合并提取液，用旋转蒸发仪50℃浓缩，回收甲醇，获得粗提物浸膏72.54 g。取其中10 g冷冻干燥备用，剩余浸膏用少量甲醇热熔，于50℃水浴锅中与60.00 g硅胶（80～100目）充分拌匀，蒸干溶剂，装入硅胶层析柱 （40 mm×600 mm， 200～300目硅胶500.00 g），先后加入脱脂棉和无水硫酸钠填充柱体，依次用乙酸乙酯石油醚和乙酸乙酯甲醇两种体系进行梯度洗脱，各梯度溶剂为3 500 mL，每200 mL为1个流分，减压浓缩。各流分以石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同极性配比液为展开剂，用254 nm紫外灯（TLC）或碘缸检识，在薄层层析硅胶板（GF254）展开比较，合并Rf值相近的流分，最终获得11个组分。
　　1.5 龙须藤甲醇提取物对真菌生长的抑制作用
　　在电子天平上准确称量0.50 g龙须藤茎皮甲醇浸提物于15 mL样品瓶中，用1 mL丙酮溶解，超声助溶，于超净工作台中用含0.1%吐温80的无菌去离子水定容至50 mL，配成10 mg/mL母液。用同种方法分别称取0.25 g各分离组分于样品瓶中，等量丙酮溶解，超声助溶，同等条件定容至50 mL，配成5 mg/mL母液备用。
　　采用菌丝生长速率法[19]。分别制备含1 mg/mL甲醇浸提物及含0.5 mg/mL分离组分的PDA培养基，以等量溶剂为对照[18]，将供试菌接种至培养基平板中间，每处理3次重复，置于28℃生化培养箱中培养。每天观察菌落生长情况，当对照组的菌落长至培养皿底部3/4面积时用十字交叉法测量菌落直径[20]，计算菌落生长抑制率。
　　菌落生长抑制率=
　　对照组菌落直径-处理组菌落直径对照组菌落直径×100%。
　　1.6 龙须藤甲醇提取物对植物根和芽生长的抑制作用
　　采用种子生物测定法[21]。取两张中速滤纸铺于90 mm 培养皿中，分别将1 mg/mL甲醇浸提物及0.5 mg/mL分离组分滴于培养皿中，每皿加5 mL，以等量溶剂为对照，每处理3次重复。种子室内催芽，挑选发芽势相同的種子铺于滴有药液的培养皿内，每皿15粒。置于人工气候箱内培养，于温度28℃，湿度70%，光照度1 100 lx，光周期L∥D=14 h∥10 h下培养3～4 d，测量其根长和芽长，计算相对抑制率。
　　根（茎）生长抑制率=对照组根（茎）长度-处理组根（茎）长度对照组根（茎）长度×100%。
　　1.7 数据统计
　　所有试验平行测定3次，数据均以“平均值±标准差”表示，用Microsoft office 2010和DPS v 13.5进行数据统计和分析;不同处理采用方差分析和Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验（P<0.05）。
　　2 结果与分析
　　2.1 甲醇浸提物的制备与分离
　　采用上述提取方法，得到龙须藤茎皮浸膏72.54 g，提取率为29.01%。取其中62.54 g（10 g冷冻干燥备用）经柱层析分离、TLC检测，整合相同流分，减压脱除溶剂，得到11个组分，总质量26.10 g（表1），回收率41.73%。
　　2.2 龙须藤甲醇浸提物对真菌生长的抑制作用
　　抑菌活性试验结果（表2）显示，龙须藤茎皮甲醇浸提物及部分分离组分对供试病原菌有不同程度的抑制效果，其中3号组分对水稻纹枯病菌，10号组分对西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌和水稻稻瘟病菌的抑制效果均超过50%，10号组分对西瓜枯萎病菌的抑制效果最好，抑制率为80.00%。
　　2.3 龙须藤甲醇提取物对植物根芽生长的抑制作用
　　对油菜和稗草根芽生长的抑制试验结果（表3）显示，龙须藤茎皮甲醇浸提物对供试种子芽和根的生长都没有抑制效果，可能由于粗提物的成分比较复杂，该浓度下有效成分不表现抑制作用。但分离组分中除了6号组分对供试种子芽和根的生长都没有抑制效果外，其余组分都表现出了一定的抑制活性，其中2号组分对油菜和稗草根的生长抑制率都超过了60%，分别为60.12%±2.77%和68.80%±2.33%;3号组分对油菜根的生长抑制率也达到了60%。由此可见，2号和3号组分中存在活性较高的抑制油菜和稗草生长的物质。
　　3 结论与讨论
　　龙须藤是一种重要的中药材，在医学领域有着广泛的用途，但在农用生物活性方面的研究与开发方面却鲜有报道，本研究以6种农业有害真菌和两种常见田间单双子叶植物为供试生物，研究龙须藤茎皮甲醇提取物的农用生物活性。将龙须藤茎皮用甲醇冷浸提取，浸提物采用硅胶柱层析进行初步分离。首次测试了甲醇浸提物和分离组分的离体杀菌和除草活性。结果表明龙须藤甲醇浸提物对稻瘟病菌表现出一定的抑制效果，对油菜和稗草的根和芽均没有抑制作用，但是大部分分离组分对供试病原菌和植物的根、芽都表现出一定抑制作用。杀菌活性方面： 10号组分对西瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑制效果最好，抑制率分别达到了80.0%和78.0%，可进一步分离纯化出高活性的化合物单体，有望开发出新的植物源农药，用于作物上西瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的防治;除草活性方面：1～3号组分对油菜根的抑制率较高，均超过了50%，2号组分对稗草根的抑制效果最好，抑制率达到了68.80%。由此可初步确认龙须藤茎皮中存在具有较强除草活性的物质，具备开发为新型植物源除草剂的潜力。与合成农药相比，植物源农药不仅对环境友好，而且往往具有复杂的作用机制和新颖的靶标，是当前农药开发与研究的热点。本研究阐明了龙须藤茎皮甲醇浸取物的部分分离组分具有良好的农用杀菌和除草活性，可为利用龙须藤开发新型植物源农药提供新思路。 　　参考文献
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　　（责任编辑：杨明丽）
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