何首乌经枯草杆菌发酵后体外生理活性的变化

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　　摘要：【目的】分析何首乌经枯草杆菌发酵炮制后的生理活性变化，为研究何首乌的有效发酵炮制方法及开发何首乌炮制产品提供科学依据。【方法】用枯草杆菌对何首乌生品进行发酵，考察何首乌生品和发酵品不同提取液（水和70%乙醇）的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除率、亚硝酸盐清除能力、酪氨酸酶抑制率及血管紧张素转换酶（ACE）抑制效果，评价何首乌发酵前后的抗氧化性、抑制黑色素和抗高血压等体外生理活性变化情况。【结果】何首乌生品和发酵品乙醇提取液的DPPH清除率分别为86.61%和96.24%，发酵品不同提取液的DPPH清除率均高于生品，且极显著高于人工抗氧化剂丁基羟基茴香醚（BHA）和二丁基羟基甲苯（BHT）（P<0.01，下同）;何首乌生品和发酵品的亚硝酸盐清除率随pH降低而升高，pH为1.2时何首乌发酵品和生品乙醇提取液的亚硝酸盐清除率分别为97.74%和92.38%，二者间差异极显著;何首乌生品和发酵品乙醇提取液的酪氨酸酶抑制率分别为89.38%和97.04%，发酵品不同提取液的酪氨酸酶抑制率极显著高于生品;何首乌发酵品水和乙醇提取液的ACE抑制率分别为32.41%和35.67%，极显著高于生品（22.96%和31.43%）。【结论】何首乌经枯草杆菌发酵其后体外生理活性均增强，且以有机溶剂乙醇溶液提取的生理活性效果更佳，该发酵方法是一种安全、可靠、有效的炮制方法，具有良好的应用价值和推广前景。
　　关键词： 何首乌;枯草杆菌;发酵;生理活性
　　中图分类号： S567.239                   文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0131-06
　　0 引言
　　【研究意义】何首乌是蓼科蓼属多年草本植物，其主要用药部分为块根，被称为中药何首乌，是临床常用中药（赵明宇，2018）。何首乌主要成分包括二苯乙烯苷类、蒽醌类等（任红微等，2018），生首乌具有解毒、截疟、润肠通便等功效，制首乌具有补肝肾、益精血、乌须发、抗衰老、强筋骨等功效（国家药典委员会，2010），临床上多采用制首乌入药。何首乌历代炮制方法有净制、切制、不加辅料制、加辅料蒸制、药汁制、发酵制、微波蒸制、高压蒸制等（张庆华和易炳学，2014），不同的炮制方法会使何首乌中化学成分发生不同变化，生理活性也会相应发生变化。发酵炮制方法是一种新型炮制方法，石聪等（2011）、杜晨晖等（2012）研究表明，用微生物炮制何首乌，条件温和，可在破坏有毒成分的同时保持有效成分稳定，相比其他传统炮制方法更加安全可靠。因此，研究何首乌发酵炮制新方法，考察其体外生理活性变化，筛选出优秀的发酵菌株，对开发何首乌发酵药品、保健品及其在临床上使用均有重要意义。【前人研究进展】目前，已有不少采用微生物进行何首乌发酵炮制的研究。杜晨晖等（2008，2012）研究表明，何首乌经米根霉发酵后，其泻下作用有所降低，并筛选出具有专一性降解蒽醌类成分而不破坏二苯乙烯苷能力的菌株米根霉和YMS-006;石聪等（2011）研究发现，何首乌经微生物发酵后，通过光谱分析法得到的6个化学成分与生何首乌相比無明显变化;Yu等（2012）比较传统炮制和发酵炮制何首乌的抗氧化活性及致泻作用，结果发现何首乌经炮制后抗氧化性活性均有所降低，但发酵何首乌可以最大程度保留何首乌的抗氧化活性且降低致泻作用，米根霉是其中较理想的发酵菌株;范琼和金明坤（2014）的研究结果表明，何首乌经乳酸杆菌发酵后总多酚和总黄酮含量均增加，抗氧化作用也明显增强。【本研究切入点】枯草杆菌是一类对人体安全的微生物，有长期制备发酵食品的历史，进入人体后可抑制致病原菌，提高人体细胞免疫功能，被美国食品药品管理局（FDA）和中国农业农村部等部门批准为食品级安全菌株（王金斌等，2014）。但目前鲜见选用枯草杆菌对何首乌进行发酵炮制的研究报道。【拟解决的关键问题】采用枯草杆菌对何首乌进行发酵炮制，考察何首乌生品和发酵品不同提取液的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除率、亚硝酸盐清除能力、酪氨酸酶抑制率及血管紧张素转换酶（ACE）抑制效果，评价何首乌发酵后的抗氧化性、降低胃癌率、抑制黑色素和抗高血压效果等体外生理活性变化情况，评估枯草杆菌发酵对何首乌的炮制效果，为研究何首乌的有效发酵炮制方法和开发何首乌炮制产品提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1. 1 试验材料
　　何首乌为广东省德庆县产，经中国热带农业科学院农产品质量安全研究所鉴定为蓼科植物何首乌的干燥根;枯草杆菌购自韩国首尔大学细菌库。DPPH、二丁基羟基甲苯（BHT）、丁基羟基茴香醚（BHA）、蘑菇酪氨酸酶（110 units/mL）、ACE（EC 3.4.15.1）和马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）均购自美国Sigma-Aldrich公司，其他试剂均为分析纯。主要仪器设备：立式压力蒸汽灭菌锅（韩国Inchun公司）、UV-1601型紫外可见分光光度计（日本SHIMADZU公司）、冷冻干燥机（韩国Inchun公司）、Supra 21K高速离心机（韩国Inchun公司）。
　　1. 2 试验方法
　　1. 2. 1 样品前处理 将生何首乌洗净切片，60 ℃烘干，粉碎后过100目筛，存放于干燥器中作为何首乌生品待用。称取500 g何首乌生品粉末置于锥形瓶中，加入500 mL蒸馏水按1∶1（m∶v）比例制备成何首乌混悬液，在蒸汽灭菌锅中121 ℃下灭菌10 min，冷却后接种5.0 mL枯草杆菌，发酵72 h，发酵液用冷冻干燥机干燥，粉碎后过100目筛，存放于干燥器中作为何首乌发酵样品待用。
　　1. 2. 2 何首乌提取物溶液制备 乙醇提取液：分别取何首乌生品和发酵品粉末25 g，加入250 mL 70%乙醇，在恒温振荡器中振荡24 h，离心过滤，用70%乙醇将滤液补齐至250 mL，所得滤液分别为何首乌生品和发酵品的乙醇提取液。水提取液：取何首乌生品和发酵品粉末各25 g，加入250 mL蒸馏水，85 ℃水浴回流5 h，离心过滤，并用蒸馏水将滤液体积补齐至250 mL，所得滤液分别为何首乌生品和发酵品的水提取液。 　　1. 2. 3 DPPH自由基清除率测定 参照范琼和金明坤（2014）的方法，分别吸取0.1 mL何首乌生品、发酵品提取液、1.0 mg/mL BHT和1.0 mg/mL BHA溶液，各加入0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）0.4 mL后混匀，再加入0.5 mL 0.15 g/L的DPPH-乙醇溶液，混匀后在室温下反应20 min，于517 nm处测定其吸光值，以蒸馏水为参比溶液，根据公式（1）计算清除率。
　　DPPH自由基清除率（%）=（1- [A-BC]）×100 （1）
　　式中，A为DPPH溶液与提取液的吸光值，B为Tris-HCl缓冲液与提取液的吸光值，C为DPPH溶液与提取溶剂的吸光值。
　　1. 2. 4 何首乌提取液降解亚硝酸盐含量测定 采用稍加改良后的Griess试剂比色法进行测定，取1.0 mL何首乌生品和发酵品提取液分别加入10 mL比色管中，再加入1 mmol/L亚硝酸钠标准溶液2.0 mL后混匀，分别将溶液pH调至1.2、3.0和5.0后定容，在37 ℃下反应1 h，取1.0 mL反应液加入5.0 mL 2%乙酸和0.4 mL Griess试剂，摇匀，静置15 min后，在520 nm处测定溶液吸光值。根据公式（2）计算样品对亚硝酸盐的清除率。
　　亚硝酸盐清除率（%）=（1- [A-BC]）×100       （2）
　　式中，A为提取液与Griess试剂的吸光值，B为提取液与蒸馏水的吸光值，C为蒸馏水与Griess试剂的吸光值。
　　1. 2. 5 何首乌提取液对酪氨酸酶抑制作用测定 参照刘杰超等（2013）的方法稍加修改后测定，取何首乌生品和发酵品提取液各500 ?L置于2 mL比色管中，分别加入0.175 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH 6.8）200 ?L和5 mmol/L L-DOPA 200 ?L，混匀后加入蘑菇酪氨酸酶液100 ?L，35 ℃保温2 min，在475 nm的吸光值下测定酶活力。将酪氨酸酶液换成蒸馏水作空白对照，根据公式（3）计算样品提取液对酪氨酸酶的抑制率。
　　酪氨酸酶抑制率（%）=（1- [A-BC]）×100   （3）
　　式中，A为提取液与L-DOPA试剂反应的吸光值，B为提取液与蒸馏水反应的吸光值，C为蒸馏水代替酪氨酸酶与L-DOPA试剂反应的空白组吸光值。
　　1. 2. 6 何首乌提取液对ACE抑制作用测定 根据宋田源等（2017）的方法稍作修改进行测定。取何首乌生品和发酵品提取液各10 ?L置于2 mL比色管内，分别加入15 mmol/L底物HHL溶液50 ?L和磷酸盐缓冲液（pH 8.3）40 ?L，摇匀，37 ℃恒温水浴预热5 min，加入50 ?L ACE酶液，混匀， 37 ℃水浴1 h后，加入1 mol/L HCl 250 ?L终止反应;然后加入1.5 mL乙酸乙酯，混匀后在10000 r/min转速下离心10 min，吸取上层乙酸乙酯1.0 mL移至另一比色管中，置于100 ℃烘箱中挥发30 min，待乙酸乙酯挥发完全，取出比色管冷却，加入3.0 mL 1 mol/L NaCl，混匀，在228 nm处测定吸光值。ACE抑制率計算公式如下：
　　ACE抑制率（%）=[A-BA-C]×100 （4）
　　其中，A为提取剂代替提取液，与ACE和HHL完全反应的吸光值，B为提取液与ACE和HHL反应的吸光值，C为反应前失活ACE，加提取液后与HHL反应的吸光值。
　　1. 3 统计分析
　　所有试验数据均以3次重复的x±s表示，用Excel 2007进行单因素方差分析。
　　2 结果与分析
　　2. 1 何首乌生品和发酵品对DPPH自由基的清除效果
　　从表1可看出，与人工抗氧化剂BHA和BHT的DPPH清除效果相比，何首乌发酵品的水提取液和乙醇提取液对DPPH的清除率（94.32%和96.24%）极显著高于BHT（88.86%）和BHA（88.98%）（P<0.01，下同），生品的水提取液和乙醇提取液对DPPH的清除率（83.69%和86.61%）极显著低于BHA和BHT;何首乌生品和发酵品两种提取液的DPPH清除效果相比较，结果显示，何首乌生品和发酵品的乙醇提取液DPPH清除率均极显著高于水提取液。
　　2. 2 何首乌生品和发酵品对亚硝酸盐的清除效果
　　亚硝酸盐在胃中酸性条件下与胺类及氨基酸等反应生成亚硝胺和亚硝酰胺，而亚硝胺和亚硝酰胺对人体具有致癌作用（张立娟和陈睿，2013），因此，清除亚硝酸盐是有效防止亚硝胺致癌的主要途径（余华等，2005）。何首乌生品和发酵品的水和乙醇提取液在不同pH条件下对亚硝酸盐的清除率如表2所示，从表2可看出，随着pH的降低，何首乌生品和发酵品不同提取液对亚硝酸盐的清除率均极显著升高;在同一pH条件下，何首乌生品和发酵品乙醇提取液的亚硝酸盐清除率均高于水提取液的亚硝酸盐清除率;何首乌生品和发酵品对亚硝酸盐的清除率相比较，发酵品的亚硝酸盐清除率高于生品，当pH为1.2时，何首乌生品和发酵品水提取液的亚硝酸盐清除率分别为53.69%和79.17%，二者差异达极显著水平，何首乌生品和发酵品乙醇提取液的亚硝酸盐清除率分别达92.38%和97.74%，二者差异也达极显著水平。人体的胃酸值处于0.9～1.5，pH为1.2是模拟人体中胃酸的pH，表明何首乌提取液在人体消化过程中对亚硝盐有一定的清除效果，且何首乌发酵品的亚硝酸盐清除率高于何首乌生品，可降低人体胃癌发生率。
　　2. 3 何首乌生品和发酵品对酪氨酸酶的抑制效果
　　人体中酪氨酸酶常见于黑色素细胞中，是生物体合成黑色素的关键酶，与白化病、黑色素瘤等疾病相关（张捷等，2012）。本研究考察何首乌生品和发酵品对酪氨酸酶的抑制作用，结果（表3）显示，何首乌发酵后对酪氨酸酶的抑制率极显著提高，何首乌发酵品水提取液和乙醇提取液对酪氨酸酶的抑制率分别为94.57%和97.04%，而何首乌生品水提取液和乙醇提取液对酪氨酸酶的抑制率分别为82.35%和89.38%。表明何首乌具有一定的抑制黑色素效果，经枯草杆菌发酵后何首乌抑制黑色素效果增强，同时，何首乌生品和发酵品乙醇提取液抑制黑色素的效果优于水提取液，差异极显著。 　　2. 4 何首乌生品和发酵品对ACE的抑制效果
　　抑制ACE被认为是一个控制高血压的有效治疗方法，而ACE抑制模型被证明是一个有效筛选抗高血压药物和功能食品的方法（赵瑜等，2017）。从表4可知，何首乌发酵品水提取液和乙醇提取液对ACE的抑制率分别为32.41%和35.67%，均高于生品（22.96%和31.43%）且差异极显著;乙醇提取液的ACE抑制率高于水提取液，差异极显著。表明发酵的何首乌具有开发抗血压功能性药品的潜力。
　　3 讨论
　　虽然目前已有关于何首乌发酵炮制的研究，但何首乌发酵后的生理活性，特别是降血压、降亚硝酸盐和抑制黑色素等作用的研究尚无报道。本研究首次选用枯草杆菌对何首乌进行发酵，何首乌经枯草杆菌发酵后，其DPPH自由基清除率、亚硝酸盐清除率、酪氨酸酶抑制率及ACE抑制率等生理活性指标明显提高。选用常用无机提取溶剂水和具有代表性的有机溶剂70%乙醇对何首乌进行提取，分析比较各项生理活性指标，结果表明何首乌发酵品和生品的乙醇提取液生理活性均高于发酵品和生品的水提取液，可能与何首乌中主要抗氧化性成分总蒽醌、二苯乙烯苷、总多酚、类黄酮等更易溶解于乙醇溶剂有关（周莹等，2014）。范琼和金明坤（2014）研究表明，何首乌经乳酸杆菌发酵后抗氧化成分总多酚和黄酮含量增加，发酵品水提取液和乙醇提取液的DPPH清除率分别为89.95%和94.62%，对亚硝酸盐的清除率在pH 1.2时分别为70.0%和98.2%。本研究结果与之相比，枯草杆菌发酵何首乌的抗氧化和降解亚硝酸盐生理活性效果优于乳酸杆菌，是值得开发和推广的何首乌发酵菌株。王真（2011）的研究结果表明，何首乌经微生物发酵后，不会产生新的化学成分，但蒽醌类物质和二苯乙烯苷的化学成分含量会增加，使得药理活性增强。因此可初步推断，何首乌经枯草杆菌发酵后有效抗氧化成分增加，生理活性得到增强。
　　王鹏等（2013）研究表明，人体内有害自由基是导致人体衰老和多种疾病产生的重要原因。黑色素的合成也与人体内产生过量的自由基有关，自由基可参与黑色素过程中酪氨酸酶的表达水平，促成黑色素合成，对人体产生危害。很多天然产物在抑制黑色素瘤和黑色素细胞的同时均表现出显著的抗氧化和清除自由基能力。因此，本研究中何首乌发酵后抗氧化、抗高血压等生理活性的提高具有相辅相成的作用，是何首乌炮制品内众多抗氧化化学成分结合作用的结果，但引起何首乌发酵后生理活性提高的具体原因在机理和化学成分的变化上还需进一步研究。
　　4 结论
　　何首乌经枯草杆菌发酵后其体外生理活性均增强，且以有机溶剂乙醇溶液提取的生理活性更强，该发酵方法是一种安全、可靠、有效的炮制方法，具有良好的应用价值和推广前景。
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