20株草菇遗传多样性的分析

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　　摘要：旨在借助分子标记手段对草菇菌株进行鉴别。利用17条扩增条带清晰、稳定的随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，简称RAPD）、简单重复序列区间（inter-simple sequence repeat，简称ISSR）引物对20株草菇菌株基因组DNA进行PCR扩增，分析草菇菌株的遗传差异。结果表明，17条引物共扩增出123条清晰的DNA片段，其大小为250～2 000 bp，其中多态性片段92条，平均多态性位点占比为74.80%。DNA电泳结果表明，所有供试菌株间的DNA指纹均存在差异。
　　关键词：草菇;菌株;分子标记;遗传多样性
　　中图分类号：S646.1+303.2
　　文献标志码：A
　　文章编号：1002-1302（2020）16-0194-03
　　草菇[Volvariella volvacea （Bull.ex Fr.） Sing.]别称苞脚菇、兰花菇、麻菇、贡菇、秆菇、中国菇等，是一种喜温、喜湿、自然发生于稻草上的草腐真菌，因而得名。草菇原产于我国热带及亚热带地区，在我国各地都有栽培。草菇栽培原料广泛，味道鲜美，营养价值丰富[1-4]，深受广大消费者喜爱。草菇属于高温型菌类，栽培原料及栽培方式多样化，但是由于低产、不稳产等原因，制约了草菇的发展。真菌的鉴定方法主要有形态学方法及分子标记方法等，草菇的形态学区别不大，而分子标记鉴定可以克服形态学鉴别的不足。随着分子生物技术的发展，如序列特征化扩增区域（sequence charactered amplified region，简称SCAR）简单重复序列区间（inter-simple sequence repeat，简称ISSR）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，简称RAPD）、简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）等分子标记技术已被广泛应用到鲍鱼菇、草菇、香菇、金针菇、杏鲍菇、双孢蘑菇、黑木耳、野生蘑菇等食用菌遗传多样性、品种鉴定和育种研究中[5-20]。ISSR、RAPD这2种分子标记技术具有简单、快速、稳定性强的特点，已经被广泛用于食用菌的遗传多样性、品种鉴定、系统进化等研究中。本研究对收集的20株草菇菌株进行ISSR、RAPD遗传多样性分析，旨在为草菇鉴定及育种提供分子依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验菌株
　　20株试验菌株见表1，均保藏于福建省食用菌种质资源保藏管理中心。
　　1.2 试剂与仪器
　　十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB）抽提液：2% CTAB（50～100 mg/L），100 mmoL/L Tris-HCl，pH值 8.0;20 mmoL/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，简称EDTA）;Bio-Rad C1000 PCR仪;DYY-12型电泳仪，北京六一仪器厂;GL-20G-Ⅱ 高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂。
　　1.3 草菇菌丝体的制备
　　将草菇马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）试管菌种接种在PDA液体培养基中，35 ℃摇床培养8 d，收集菌丝，称取1 g菌丝用滤纸包好，保存于-20 ℃备用。
　　1.4 基因组DNA的提取
　　取1 g菌丝放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，将粉末转入7 mL离心管中，用CTAB法提取DNA，于-20 ℃保存备用，具体操作参考熊芳等的试验方法[5-6]。
　　1.5 PCR扩增
　　供试的RAPD、ISSR引物序列参照江玉姬等的研究[7]。RAPD、ISSR这2种标记的PCR反应体系组分见表2。RAPD PCR程序設定如下：94 ℃预变性 7 min;94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。ISSR PCR程序设定如下：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性 1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。电泳扩增方法：取 10 μL 扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，保持160 V恒压，电泳时间为1.5 h，通过紫外凝胶成像系统观察并拍照。
　　1.6 聚类分析
　　根据电泳图上的扩增片段进行统计，有相应多态性条带的记为“1”，无相应多态性条带的记为“0”，将统计形成的“0-1”数据表输入NTSYS-PC V2.10数据统计分析软件中，采用平均连锁法（UPGMA）进行聚类分析，生成遗传聚类图。
　　2 结果与分析
　　2.1 PCR扩增全模板电泳结果
　　选用17条扩增条带清晰、稳定的RAPD、ISSR引物，通过PCR扩增获得DNA指纹图谱（图1、图2）。可以看出，每个引物对不同菌株扩增得到的DNA条带数不等，一般为3～13个，绝大多数扩增片段大小为200～2 000 bp;部分扩增产物片段为所有菌株共有，说明草菇菌株基因组的相应结合位点比较保守，该区域可作为草菇菌株物种特征遗传信息。
　　2.2 PCR扩增产物的多态性分析
　　采用17条引物对20个草菇菌株进行遗传多样性分析，结果显示，17条引物均能扩增出稳定性强、可重复性高且多态性丰富的带型。由表3可见，不同引物所扩增条带的多态性频率不同，引物S227、S380、S1010、811、864、868所扩增条带的多态性位点频率均达到100.00%，17条引物所扩增条带的平均多态性频率为73.18%。另外，由17条随机引物扩增得到的共123个RAPD、ISSR位点中，有92个位点具有多态性，其多态性频率为74.80%。试验结果表明，草菇菌株之间具有丰富的遗传多样性。 　　2.3 基于RAPD、ISSR的系统综合聚类结果
　　通過NTSYS-PC聚类分析软件分析得出，草菇菌株之间的遗传多样性比较丰富。此外，借助RAPD、ISSR分子标记技术可以将20株菌株完全区分开。由图3可以看出，亲缘关系较近的菌株有13号、20号;11号草菇（上海草菇）菌株与其他草菇菌株之间的亲缘关系较远。在相似系数为0.21左右处，可以将20株菌株分为13类;有11株菌株为单独的1类，分别为1、7、8、5、10、14、15、19、18、17、11号菌株;第12类为2、9号菌株;第13类为3、4、6、16、12、13、20号菌株。
　　3 讨论
　　草菇是我国重要的食用菌品种之一，属于高温菌，目前对草菇遗传物质的研究尚较少。草菇是初级同宗结合的食用菌，与其他食用菌相比，其有性后代存在更加广泛的遗传变异。余志晟等利用RFLP、RAPD方法对国内12株草菇栽培菌株进行分析，结果表明，菌株间的平均相似系数为0.707[17];江玉姬等利用RAPD、ISSR、相关序列扩增多态性（SRAP）3种分子标记对来自不同地区的74株草菇菌株进行遗传多样性分析，结果表明，菌株之间的相似系数范围为0～0.79，具有较丰富的遗传多样性[7]。韦仕岩等借助筛选到的9个ISSR引物对17株草菇菌株基因组DNA进行了遗传差异分析，结果表明，草菇菌株之间的相似系数为0.63～0.95[18]。
　　4 结论
　　本研究选用17条多态性高、分辨率强的RAPD、ISSR引物对收集到的20份草菇种质DNA进行扩增，结果表明，草菇RAPD、ISSR带型表现出较高的多态性，多态性带型占74.80%。可见草菇菌株之间虽然存在差异性，但是差异较小，缺少差异性较大的资源，因此今后应加强草菇种质资源的挖掘。本研究结果为草菇菌株聚类分析及品种选育提供了分子水平的依据。
　　参考文献：
　　[1]黄 毅. 食用菌栽培[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2008：10-22.
　　[2]邓优锦，朱 坚，谢宝贵. 图说草菇栽培关键技术[M]. 北京：中国农业出版社，2011：6-9.
　　[3]张树庭. 草菇[M]. 香港：香港中文大学出版社，1975：17-19.
　　[4]罗贵伦. 草菇的营养价值[J]. 四川食品工业科技，1995（3）：49-53.
　　[5]熊 芳，郑闽江，刘新锐，等. 鲍鱼菇种质资源SCAR标记的建立及其初步应用[J]. 中国农学通报，2010，26（11）：330-335.
　　[6]傅俊生，刘新锐，谢宝贵，等. 草菇SCAR遗传标记建立及其杂种鉴定应用[J]. 中国农学通报，2010，26（17）：41-46.
　　[7]江玉姬，邓优锦. 74株草菇遗传多样性分析[J]. 核农学报，2015，29（11）：2084-2092.
　　[8]龚利娟，李 玉，刘淑艳. 香菇品种遗传多样性RAPD分子标记的研究[J]. 菌物研究，2005，3（1）：17-21.
　　[9]王秀全，江玉姬，刘维侠，等. 利用RAPD标记金针菇的亲缘关系研究[J]. 菌物学报，2005，24（增刊1）：142-146.
　　[10]辜运富，张小平，陈强袁，等. 双孢蘑菇种内多态性的AFLP分析[J]. 西南农业学报，2003，16（4）：39-43.
　　[11]黄晨阳，张金霞，郑素月，等. 刺芹侧耳rDNA的IGS2多样性分析[J]. 农业生物技术学报，2005，13（5）：592-595.
　　[12]唐利华，肖 扬，边银丙. 中国黑木耳主要栽培菌株ISSR指纹分析及SCAR标记[J]. 菌物学报，2008，27（2）：243-251.
　　[13]陈美元，廖剑华，王 波，等. 中国野生蘑菇属90个菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 食用菌学报，2009，16（1）：11-16.
　　[14]任广明，李镇华，郭 兴，等. 黑木耳栽培菌株亲缘关系的ISSR分析[J]. 东北林业大学学报，2011，39（5）：99-101.
　　[15]吕长武，吕 杰，陈恒雷，等. RAPD分子标记在食用菌研究中的应用[J]. 中国生物工程杂志，2006，26（1）：77-80.
　　[16]冯伟林，蔡为明. ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株的遗传并差异研究[J]. 中国食用菌，2009，28（1）：47-49.
　　[17]余志晟，吕作周. 草菇栽培菌株DNA多态性PCR-RFLP和RAPD分析[J]. 中国农学通报，2005，21（6）：58-62.
　　[18]韦仕岩，吴圣进. 草菇菌株的ISSR遗传差异分析[J]. 热带作物学报，2013，34（11）：2209-2213.
　　[19]孙 勇，林芳灿. 中国香菇自然种质遗传多样性的RAPD分析[J]. 菌物系统，2003，22（3）：387-393.
　　[20]边银丙，宋小亚. 几种新型DNA分析标记及其在食用菌研究中的应用[J]. 食用菌学报，2006，13（1）：78-81.
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