牛初乳IgG的分离提纯方法研究

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　　摘要：牛初乳中的免疫球蛋白是动物体内免疫系统最为关键的物质之一,有抑制毒素和病原微生物等功能。国内外在提取活性免疫球蛋白的方法上均有大量的研究,依据不同用途选择提取纯化方法,并将不同方法进行组合使用,可以收到良好的制取效果。
　　关键词：牛初乳 IgG 分离 提纯
　　1.免疫球蛋白G(IgG)生化特性及生理功能
　　牛初乳IgG免疫活性的变化主要受消化道内pH值和各种蛋白酶的影响。张和平等(1997)研究IgG在体外的消化特性时发现，在pH 2．0及存在胃蛋白酶时IgG损失较大，在pH 4．0及存在胃蛋白酶时IgG损失较小，在pH 7．0及存在胰蛋白酶时IgG则能够很好地保持免疫活性。在胃肠道中，牛初乳IgG则能够有效地抵抗酸和酶的降解，保持其免疫活性。这是因为牛初乳含有能够抑制蛋白酶活力的某些糖蛋白和能够有效保护活性因子免受蛋白酶破坏的其他酶抑制剂。IgG等抗体物质具有特殊的天然结构，许多研究证实IgG是乳清蛋白中对蛋白酶降解具有较高抗性的组分，这是生物进化的结果。
　　2.牛初乳IgG的分离提纯方法
　　2.1 膜分离技术的应用
　　膜分离技术作为生化分离技术的一项主要内容，已被世界许多国家的乳品行业采用。现已应用到乳品行业的膜分离技术有超滤(uF)、反渗透(RO)和纳滤(NF)。膜技术在乳清蛋白回收、乳糖的分离、乳清脱盐、牛乳浓缩等方面都取得了很大成果和经济效益。用膜分离技术来分离牛初乳中的IgG可避免因酸沉淀、受热对IgG分子结构、活性的破坏，得到高效的免疫球蛋白。
　　 张小平研究了超滤分离牛初乳乳清中IgG的方法，测定不同超滤温度和压力条件下IgG含量和活性的变化情况。结果表明：通过超滤可将乳清中IgG含量提高一倍左右；超滤压力增加，IgG含量相应增加，IgG活性基本不变。在压力0.08 MPa时，IgG含量为45.98mg／mL，活性未变，仍为1024；超滤温度增加，初乳中的IgG含量先有较小增加然后减少，IgG活性则下降。在超滤温度40度时，IgG含量最高，达到46.85 mg／mL，IgG活性未有变化。采取单一的超滤方式分离提纯工艺所得目标蛋白纯度往往很低。
　　2.2 离子交换色谱的应用
　　脱脂牛初乳用浓度为6 mol／L的盐酸调节其pH至4．0，以5 ooo r／min离心分离20 min除去酪蛋白制得乳清，缓慢滴加浓度为1 mol／L的氢氧化钠回调pH至6．8；处理后的乳清经截留相对分子质量为50 ooo的组分并超滤稀释后，再经过阴阳离子交换串联色谱，免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)吸附于DEAE Sepharose Fast Flow；阴离子交换柱用c(NaCI)=17 mmoVL、51 mmol／L的水溶液阶跃洗脱，得到色谱纯度为95％的IgG产品。
　　王晓工等采取二甲基十二烷基苄基溴化铵(Dimethyllaurbenzylammonium，简称DMLBAB)作为预处理介质，采用离子交换色谱和凝胶过滤色谱联合分离纯化牛初乳中的IgG，和IgG2。最终实际取得实验室制备规模的目标物，其含量最高为：IgG1总量在85％～90％之间，其中IgG2含量占90％。
　　但上述分离一般只针对牛初乳中单一活性蛋白进行提纯，所用盐析与凝胶过滤分离单元操作，大大限制了分离工艺的工业化；范丽娟、潘道东采用硫酸铵一次性盐DEAE-SepharoseFF离子交换层析和SephacrylS-200凝胶过滤层析法,分离纯化免疫初乳中的IgG,并采SDS-PAGE电泳、单向火箭免疫电泳及试管凝集法对IgG分离物进行了定性定量检测,结果表明所得IgG纯度高,活性大。2.3高效液相色谱法
　　高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatograph，HPLC)利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。HPLC法具有分离效率高、应用范围广、分析速度快、样品用量少而且灵敏度高、分离和测定一次完成、易于自动化，可在工业流程中使用等优点。
　　熊勇华等运用凝胶色谱柱(TSK―G3000sW))建立了牛初乳中IgG的高效液相色谱检测法。流动相为0.1 mol/LPB +0.1 mol/L Na2SO4+0.05％ NaN3(pH6.7)；流速1．0 mL/min；UV(280 nm)检测。实验得出牛初乳中IgG含量在40-70 mg/mL之间，3d后初乳IgG含量总量下降很快，第7d IgG含量平均在1- mg/mL之间；其线性相关系数R=0.9915，回收率平均大于98.5％。
　　2.3 高效亲和色谱法
　　杨祖英等 采用高效亲和色谱柱Pharmacia HI-TrapProtein G柱，在pH6.5磷酸盐缓冲液条件下将样品中的IgG与配基连接，在pH2.5的盐酸甘氨酸条件下洗脱IgG进行测定。PDAD(280 nm)检测；流动相A液(pH6.50.05 mol/L磷酸盐缓冲液)和B液(pH2.50.05 mol/L的盐酸甘氨酸缓冲液)，并进行梯度洗脱。实验得出其线性相关系数为0.9960，最低检出浓度为0.5 mg/g，回收率为88％-102％。李莉在与杨祖英实验中所用的色谱柱、检测波长、流动相相同的情况下，得出IgG保留时间为11.7 min，平均回收率为93.16％，批内相对标准偏差为2.2％
　　件下离心20-30min,得较高纯度的IgG。
　　结束语：
　　综上所述，进行牛初乳IgG的分离提纯方法有很多，针对牛初乳理化性质进行研究，每一种方法都有它的优点和弊端，但在科研和时间生产实践中都得到了应用，并不断的探索和研究，使得牛初乳IgG的分离提纯方法研究更加深入和广泛，其分离提纯方法和体系也更加完善，相信在今后的科研中会有更加先进的方法被研发出来，让牛初乳IgG的分离提纯更加科学和完善。
　　
　　参考文献：
　　[1]于立芹，庞广昌,牛初乳中生物活性成分的研究进展[J]，食品科学，2007，28(9):604.
　　

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