新城疫弱毒疫苗病毒载量的比较检测

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　　摘 要：用PCR方法扩增新城疫病毒（NDV）的M基因片段，构建含有M基因片段的重组质粒，以不同浓度的NDV-M基因重组质粒为模板，用SYBR Green I方法来建立检测NDV载量的荧光定量PCR方法。用该方法对A、B两个厂家的新城疫弱毒疫苗的NDV载量进行了比较检测，结果发现A厂家生产的疫苗的NDV载量极显著高于B厂家生产的疫苗。
　　关键词：新城疫;荧光定量PCR
　　一、材料
　　1.ND疫苗
　　本试验选用2种鸡新城疫疫苗为：
　　疫苗A：鸡新城疫活疫苗（Clone 30株）;A厂家。
　　疫苗B：鸡新城疫活疫苗（VG/GA株）;B厂家。
　　2.试剂
　　酶类：Taq DNA聚合酶。
　　载体及菌株：载体pUC-T和大肠杆菌DH5α感受态细胞。
　　试剂盒：RNA提取试剂盒和DNA片段快速胶回收试剂盒;2×SYBR? Green Realtime PCR Master Mix;高纯度质粒小提中量试剂盒。
　　3.培养基及相关试剂配制
　　氨苄青霉素（Amp）贮存液、20mg/mL X-gal贮存液、200mg/mL IPTG 贮存液、LB培养基、LB/Amp+液体培养基、LB/Amp+固体培养基、LB/Amp+/X-gal/IPTG平板等。
　　4.琼脂糖凝胶电泳所用溶液
　　10 mg/mL GoldView、50× TAE电泳缓冲液、1×TAE电泳缓冲液、1.5%琼脂糖凝胶等。
　　5.主要仪器设备
　　MJ-PCR仪、PAC3000型电泳仪、DYYⅢ-31A/31B型电泳槽、DYYⅢ-2型稳压稳流电泳仪 、Alpha ImagBrTM2200型凝胶成像分析系统、YJ-875SA医用净化工作台等。
　　二、方法
　　1.病毒RNA的提取
　　用灭菌PBS溶解ND弱毒疫苗，按照每1000头份/5 mL PBS溶解，取250 μL溶液，按照RNA提取试剂盒使用说明书，提取病毒RNA，用100 μL TE缓冲液溶解，置于-20℃保存备用。
　　2.反转录-PCR扩增
　　上游引物NDVU：5?-ACTTGTGGACTGATAGTAAGGAGGA -3?，下游引物NDVD：5?-GCATTCA CTG ATGAGTATTTGTTTG -3?，预期扩增片段长度为319 bp。
　　3.PCR产物的克隆
　　PCR产物回收：将PCR扩增产物进行电泳观察，切下特异性目的条带，进行回收、洗脱备用。
　　PCR产物的克隆：对pUC-T载体和纯化回收后的PCR产物进行连接。
　　4.重组质粒的鉴定
　　重组质粒DNA的小量制备：将白斑接种3mL LB/ Amp+液体培养基，37℃ 振荡培养15 h;取1.5mL菌液，提取重组质粒DNA，洗脱、冷冻、保存。
　　重组质粒PCR鉴定：将质粒作50× 稀释，取1 L作模板进行PCR扩增，若扩增出预期目的片段，则视为NDV-M基因的阳性重组质粒。
　　序列测定与分析：挑取阳性重组质粒，进行测序。比对分析后，确定是否为NDV-M基因序列。
　　5.Real-time PCR标准曲线的建立
　　（1） 标准曲线的建立。将NDV-M基因重组质粒用灭菌TE溶液作10倍系列稀释，用不同稀释梯度的NDV-M基因重组质粒作为模板，使用SYBR Green方法进行Real-time PCR扩增。荧光定量PCR仪将会自动生成扩增曲线与熔解曲线。计算两两相邻浓度的NDV-M基因重组质粒模板的Ct值的差值，选用变异度小于10%的浓度质粒模板来绘制标准曲线图。
　　（2）特异性试验。用建立NDV-M基因标准曲线的条件扩增NDV Lasota株、NDV Clone-30株等核酸模板，以评价所建立的荧光定量PCR 方法的特异性。
　　（3）敏感性试验。选取4个10倍系列稀释的低浓度的NDV-M基因重组质粒，进行荧光定量PCR和常规PCR扩增，比较确定两种方法能检测到的最低浓度。
　　（4）重复性试验。将NDV-M基因重组质粒标准品置于-20 ℃保存，每隔7天取出1次，进行3次独立检测，每次每种质粒浓度均进行3次重复反应，计算Ct值的变异系数。
　　6.新城疫弱毒疫苗病毒载量的检测
　　从两种疫苗的250 μL溶液中提取病毒RNA，用100 μL TE缓冲液溶解，取7 μL 进行反转录合成20 μL cDNA，取5 μL cDNA用建立的NDV real-time PCR进行检测，比较分析两个厂家ND疫苗病毒載量的差异。
　　三、结果与分析
　　ND弱毒疫苗的检测
　　提取北京大兴区使用较广泛的2种商品ND弱毒活疫苗RNA，反转录成cDNA后分别用常规PCR和荧光定量PCR方法进行比较检测。扩增曲线和熔解曲线结果显示，A厂家生产的ND疫苗的Ct值小于B厂家。
　　四、 讨 论
　　荧光定量PCR技术，能够克服常规PCR技术所存在的假阳性较多和敏感性不够的不足。
　　用此技术对北京大兴地区使用较为广泛的2种ND弱毒活疫苗进行NDV核酸载量检测。结果发现，A厂家明显高于B厂家。两种疫苗病毒载量的明显差异，可能是两种疫苗免疫效果差异的主要原因。
　　五、小结
　　用建立的NDV SYBR GreenⅠreal-time PCR方法对数种商品ND弱毒活疫苗的病毒载量进行了比较检测，结果显示，B厂家生产的ND疫苗（VG/GA株）病毒载量极显著低于A厂家生产的ND疫苗（Clone 30株）。
　　六、结语
　　A厂家生产的ND疫苗（Clone 30株）的病毒载量极显著高于B厂家的ND疫苗（VG/GA株）。
　　参考文献：
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