HPLC法测定民族药露水草中β-蜕皮激素的含量

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　　摘要：目的 露水草中β-蜕皮激素的含量测定。方法 采用高效液相法对露水草中β-蜕皮激素含量进行测定。色谱柱为Agilent Extend-C18柱（4.6×150 mm，粒径5 μm）;流动相为甲醇-水（40：60）;柱温35℃;检测波长248 nm;流速1.00 mL/min;进样量5 μL。结果 β-蜕皮甾酮溶液在0.025 mg/mL～0.5 mg/mL濃度范围内与峰面积线性关系良好（r=0.9999）。平均回收率为102.02%（n=6），RSD值为1.0%。结论 本方法重复性好，稳定性好，精密度高，适用于β-蜕皮甾酮的含量测定。
　　关键词：β-蜕皮甾酮;高效液相色谱法（DAD UV检测器）;含量测定
　　中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2019）03-0070-05
　　20-羟基蜕皮甾酮（20-Hydroxy ecdysterone）又称β-蜕皮激素（β-ecdysone），是一种昆虫的变态激素，可用于防治害虫及提高虾蟹产量[1]。化学式为C27H44O7[2]。其不仅能促进昆虫变态，还具有很多药理活性[3]。具有促进细胞生长、刺激真皮细胞分裂、产生新的生命细胞和生殖细胞的作用[4]。还可促进动物的生长发育，促进细胞增殖分化，促进蛋白质、碳水化合物、脂肪代谢，保护神经系统、心血管系统、肝脏等功效[5]。其主要作用是促进核酸和蛋白质的合成，影响糖代谢和脂类代谢，免疫调节机体。高剂量的蜕皮激素能扰乱昆虫体内的正常代谢过程，所以用于防治害虫[6]。在运动保健方面，β-蜕皮激素具有显著的通过增加氨基酸装配成蛋白链，从而刺激肌肉细胞质中蛋白质合成的能力，而且该能力回溯至蛋白质生长的转译和转移的过程[7]。蜕皮甾酮类甾体化合物广泛的存在于不同科属的植物中[8]。迄今为止，露水草是昆明植物所聂瑞麟先生发现的自然界中含植物甾酮类成分最丰富的药用植物之一[9]。本次实验选用露水草为提取原料。露水草（Cyanotis C.B.Clark）又名珍珠露水草、换肺散、鸡冠参等，为鸭跖草科（Commelinacede）蓝耳草属多年生宿根性草本，分布于中国、印度、斯里兰卡及中南半岛，我国主要分布于云南、贵州、广西、广东、福建、台湾等省（区）海拔1100～1700 m的山沟、山坡林缘或林中[10]。
　　综合实验室条件等各种原因，此次试验采用高效液相色谱法（HPLC）测定β-蜕皮激素的含量。
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器 梅特勒托利多万分之一电子天平（型号 MS204）;电热鼓风干燥箱（型号 101-0EBS）;超声清洗仪器（型号 CPXS800H-C）;安捷伦高效液相色谱仪（型号 1260 DAD UV检测器）。
　　1.2 试药 露水草全草干草;β-蜕皮甾酮对照品（批号：111638-201304，含量以按95.8%计，中国食品药品检定研究院）;乙腈、甲醇（色谱纯）;其他化学试剂为分析纯;水为超纯水。
　　2 方法条件的选择与结果
　　2.1 检测波长的确定 精密称取β-蜕皮甾酮对照品26.10 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶，摇匀，即得浓度为每1 mL含β-蜕皮甾酮0.5001 mg的对照品贮备液。精密吸取上述溶液3 mL置50 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（浓度为30 μg/mL）。取样品0.2 g至50 mL容量瓶，加甲醇25 mL，超声40 min，取出，放冷至室温，定容至刻度，作为供试品溶液。取上述供试品溶液及对照品溶液，在乙腈-水（15：85）、乙腈-甲醇-水（14：28：58）、甲醇-水（40：60）三种流动相中分别进样，DAD UV HPLC色谱仪在波长200～600 nm扫描，得出最大吸收波长。结果显示对照品溶液及供试品溶液均在λ=248 nm处有最大吸收，且无杂峰干扰，因此后续实验检测波长确定为248 nm。
　　2.2 色谱柱的选择 选用4.6 mm×250 mm，粒径5 μm色谱柱测量时，保留时间接近半小时，用时过长，且保留时间波动较大，峰面积不稳定，所以选择4.6 mm×150 mm，粒径5 μm色谱柱，短柱保留时间在5 min左右，相比之下，缩短了试验时间，且峰面积与长柱相比较稳定。选择出4.6 mm×150mm色谱柱。
　　2.3 样品提取方法的选择 本实验采用超声提取40 min、振荡提取40 min及索式提取至无色三种方式进行提取，结果显示采用索式提取β-蜕皮甾酮含量相对较高;但预实验时索式提取四份样品精密度较差，提取近14 h才至无色比较费时且存在温度难控等因素，相较于超声及振荡提取，β-蜕皮甾酮含量相近，但考虑到操作性，最终采用超声提取。
　　2.4 提取溶剂的确定 本实验采用甲醇、乙醇两种溶剂通过超声提取40 min、振荡提取40 min及索式提取至无色三种提取方式提取，三种提取方式结果都显示甲醇溶剂提取时含量相对较高，最终确定采用甲醇溶剂提取。
　　2.5 流动相的确定 预实验时标准品以及三种方法提取所得的样品都分别在检测波长248 nm，三种流动相乙腈-水（15：85）[11]、乙腈-甲醇-水（14：28：58）、甲醇-水（40：60）[11]条件下进样。通过对比保留时间、色谱吸收峰峰型以及峰面积，乙腈-水（15：85）为流动相时出峰时间相对另外两种较长;乙腈-甲醇-水（14：28：58）为流动相时分离度达不到要求;甲醇-水（40：60）为流动相时保留时间相对较短，峰形较好，峰面积较稳定，所以确定以甲醇-水（40：60）为流动相。 　　2.6 柱温的确定 试验期间，环境温度的变化对保留时间影响较大，不同的环境温度会导致保留时间的波动。温度降低时，保留时间提前，温度升高时保留时间往后延，最大与最小保留时间相差超过0.5 min，所以将柱温从30 ℃调为35 ℃，且保持进样过程中环境温度波动较小，此条件下进样，保留时间仍有变化，但在0.4 min范围内，峰面积变化有较大改观。
　　3 溶液的配制
　　3.1 样品溶液 样品前处理：将露水草植物样品打粉后过3号筛（50目），备用。取露水草样品0.2 g至50 mL容量瓶，加甲醇25 mL，超声40 min，取出，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
　　3.2 标准品溶液
　　3.2.1 浓度为0.5000mg/mL对照品溶液 精密称取β-蜕皮甾酮对照品26.10 mg，加甲醇定容至50 mL量瓶，摇匀，即得浓度为每1 mL含β-蜕皮甾酮0.5001 mg的对照品贮备液。
　　3.2.2 浓度为0.2000mg/mL对照品溶液 精密称取β-蜕皮甾酮对照品41.75 mg，甲醇定容至200 mL量瓶，得0.2000 mg/mL对照品溶液。
　　3.3 阴性对照溶液 取不含β-蜕皮甾酮的空白样品，照供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照溶液。
　　4 色谱条件
　　色谱柱：Agilent Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，粒径5 μm），柱温：35 ℃;流动相：甲醇-水（40：60）;流速1 mL/min;进样量5μL;检测波长：248nm。
　　5 检测方法及结果
　　5.1 专属性考察 按照上述色谱条件，分别吸取三（一）、（二）、（三）项下溶液即供试品溶液、对照品溶液阴性对照溶液，各5 μL注入色谱柱，采集色谱图。
　　阴性对照品色谱在对照品出峰位置上无干扰峰，即本实验条件下对测定干扰较小，系统误差较小。对照品图谱β-蜕皮甾酮（Rt=5.166 min）。样品图谱β-蜕皮甾酮（Rt=5.091 min），且它们的分离效果都良好。
　　5.2 线性范围考察 取三.（二）.1中0.5001 mg/mL的对照品贮备液，精密量取8 mL置10 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，照此方法依次稀释，得到浓度为0.400 mg/mL、0.300 mg/mL、0.200 mg/mL、0.100 mg/mL、0.050 mg/mL、0.025 mg/mL對照品溶液。吸取上述各浓度的对照品溶液及0.5001 mg/mL的对照品溶液分别进样5 μL;按上述色谱条件测定峰面积，每个浓度各进样2针。结果见表1。
　　以β-蜕皮甾酮浓度C（mg/mL）为横坐标，平均峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归。线性回归方程为：y=7569x+9.858，r=0.9999（x：mg/mL），结果表明，在0.025 mg/mL～0.5 mg/mL浓度范围内与峰面积线性关系良好。
　　5.3 重复性 按3.1项下操作，平行配制6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，每份进样2次。结果β-蜕皮甾酮的峰面积无显著差异，其相对标准偏差RSD值为0.4%（RSD值<2%），表明该方法重复性良好，结果见表2。
　　5.4 精密度 按3.2.1项下操作分别配制两份浓度为0.2 mg/mL标准品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，每份重复进样5次，其相对标准偏差 RSD值分别为0.2%和0.3%，小于2%，故本实验的精密度满足要求的规定。结果见表3。
　　5.5 稳定性 取同一供试品溶液按上述色谱条件在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h进样5 μL，测定峰面积及RSD，结果峰面积变化不大，相对标准偏差RSD值为0.6%，小于2%，表明样品溶液在24 h内没有明显的变化是稳定的。结果见表4。
　　5.6 样品含量测定 按3.1项下操作制备供试品溶液3份，按上述色谱条件测定，每份进样2次，计算含量（本品含量按干燥品计算）结果如表5。
　　5.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的露水草样品6份（每份约取0.1 g），再分别精密加入3.2.2项下对照品溶液25 mL，超声40 min，取出，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，按上述色谱条件测定，每份进样2次，测得回收率介于100.0%～105.0%之间，RSD值为1.0%（<2%），表明回收率良好，结果见表6。
　　6 结论
　　本试验采用DAD UV HPLC色谱法测定样品中β-蜕皮甾酮的含量，本检验方法得到的标准工作曲线相关系数为0.9999，精密度的RSD值小于2%，重复性的RSD值0.4%，样品含量为0.0543g/g，加标回收率在100.0%～105.0%间。该方法适用于β-蜕皮甾酮的含量测定
　　7 讨论
　　7.1 检测波长的确定 测定进行前，吸收波长的选择至关重要。为确定β-蜕皮甾酮含量测定的检测波长，通过DAD UV高效液相色谱仪及紫外可见分光光度计扫描确定。紫外可见分光光度计检测以甲醇为空白对照，取对照品溶液及供试品溶液，在200～400 nm波长范围内扫描，结果对照品溶液在240 nm处有最大吸收波长，供试品在248 nm处有最大吸收;DAD UV高效液相色谱仪测定时在200～600 nm波长范围内扫描，结果对照品溶液及供试品溶液均在248 nm处有最大吸收。此时存在差异，但由于时间原因及本实验是采用DAD UV高效液相色谱仪进行测定，故测定波长定为248 nm。在此也希望以后有机会能对此问题做进一步研究。 　　7.2 样品提取 样品提取时，结果显示采用索式提取时，β-蜕皮甾酮含量相对较高，但提取期间，有超过10 h的提取时间间隔，可能会对测定结果造成影响。待提取剂回流至无色后，冷却装置过程中，提取管中提取剂又有颜色出现，对提取时间的确定有影响。由于存在多方面影响提取β-蜕皮甾酮的因素，排除此种提取方法。
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