应用超高效液相色谱质谱联用技术测定汉桃叶不同部位中有三种机酸的含量

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　　【摘 要】目的：建立应用超高效液相色谱串联质谱联用仪（UPLC-MS/MS）测定汉桃叶不同极性部位中反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸的含量。方法：样品用甲醇-水混合溶液溶解，以乙腈-水为流动相，流速为0.25 mL/min，在柱温30 ℃的条件下，采用负离子多反应监测（MRM）模式进行检测。结果表明，反式二烯酸、琥珀酸、苹果酸在各自浓度范围内线性关系良好;反式二烯酸和苹果酸的检测限为500ng/ml， 琥珀酸的检测限为100ng/ml。加样回收率为91.8%～95.4%，相对标准偏差为3.2%～4.4%。该方法是一种灵敏度高、准确度较高的测定反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸的方法，可以应用于其他中药材中这三种有机酸的检测。
　　【关键词】汉桃叶;提取;分离;超高效液相色谱-质谱联用技术 ;有机酸;物质基础
　　【中图分类号】  R249  【文献标识码】 B【文章編号】 1672-3783（2019）05-03-022-01
　　汉桃叶为五加科植物白花鹅掌柴（Scheffiera kwang siensis Merr.ex Li）的根或茎、叶，又名广西鹅掌柴，产于贵州[1]。汉桃叶具有祛风止痛，舒筋活络之功效。用于治疗三叉神经痛，坐骨神经痛、风湿关节痛[2]，目前被做成多种中药制剂上市，如汉桃叶胶囊，汉桃叶片等，应用较广[2]。目前汉桃叶化学成分中有机酸类成分被认是药效作用成分[3-5]，然而有机酸类成分极性较大，含量少，因此应用常规高效液相色谱技术同时定量几种有机酸难度较大[6-7]。本论文利用层析技术对汉桃叶进行分离得到不同极性部位，并采用超高效液相色谱质谱联用技术建立了对汉桃叶中三种代表性的有机酸-富马酸、琥珀酸和苹果酸的含量测定的方法，最终应用此技术对不同极性部位中的三种有机酸的含量进行测定。
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器
　　BT 25S型电子天平（德国赛多利斯有限公司）、Water Acquity I-class UPLC型液相色谱仪（美国沃特世公司）、Xevo TQ-S型串联质谱仪（美国沃特世公司）;
　　1.2 试药 液相用乙腈（美国西格玛有限公司）、液相用水为娃哈哈纯净水（中国娃哈哈有限公司）。乙醇、甲醇等试剂均为分析纯或实验室常用规格;Hp20大孔树脂（日本日立公司， 批号7G504）;
　　反丁烯二酸对照品（中国药品生物制品检定所， 批号：123049）;琥珀酸对照品（中国药品生物制品检定所， 批号：190014）;苹果酸对照品（中国药品生物制品检定所， 批号：110896）;本研究所使用的汉桃叶药材由金鸿药业股份有限公司提供。
　　2 方法
　　2.1 汉桃叶不同部位的富集 取汉桃叶药材1kg，用70%乙醇提取两次，过滤，回收醇提液，药渣干燥，后按照药典中水提醇沉方法再次提取药渣，得到水提液。将醇提液与水提液合并，浓缩干燥得到浸膏粉末100g。取汉桃叶浸膏粉末65g，将其完全溶解于300ml的去离子水中，上样至Hp20大孔吸附树脂，依次用3倍柱体积的水、10%、20%、30%、50%、75%和95%乙醇依次洗脱， 50℃减压浓缩至干浸膏，后冻干至干燥粉末，得到水洗脱部位（20.8g， 32%），10%乙醇洗脱部位（3.2g， 4.9%），20%乙醇洗脱部位（5.5g， 8.4%），30%乙醇洗脱部位（4.2g， 6.4%），50%乙醇洗脱部位（10.3g， 15.8%），75%乙醇洗脱部位（2.3g， 3.5%），95%乙醇洗脱部位（0.67， 1.0%）。
　　2.2 溶液的配置
　　2.2.1 样品的制备 称取汉桃叶各部位样品20mg于10ml容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，得2mg/ml样品溶液，过0.22 μm的微孔滤膜后直接进样检测。
　　2.2.2 标准储备溶液的配制
　　分别称取富马酸、琥珀酸标准品10mg于50ml容量瓶中，苹果酸标准品10mg于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分别得到0.2mg/ml，0.2mg/ml，1mg/ml溶液。
　　2.2.3 混合标准使用溶液的配制
　　分别取适量的对照品储备液至20ml量瓶中，根据稀释比例，用甲醇依次稀释至标准曲线所需的各浓度。绘制标准曲线，外标法定量。
　　2.3 色谱质谱条件
　　2.3.1 液相色谱条件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（1.7 μm 粒径，2.1 mm i.d × 50 mm）;流动相A和B分别为水和乙睛;流动相流速为 0.25mL·min-1。梯度洗脱条件为：0-1.2 min，5～19%B;1.2-4.2min，19～95%B; 4.2- 6.2min 95%～5%B。柱温：30 ℃，进样体积：5 μL。
　　2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源：负离子模式;干燥气（氮气）流速：12 L·min-1，离子源温度：350 ℃，雾化器（氮气）压力：45 psi，毛细管电压：3 kV;数据采集方式多反应监测（MRM）模式检测;各化合物检测条件见表1。
　　3 结果与讨论
　　3.1 线性范围和检出限 分别将2.2.3项下配制好的混标溶液按照所建立的方法进行检测。分别以苹果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的浓度为横坐标，色谱峰面积离子的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程。如表2所示，苹果酸在0.5～100μg/mL 浓度，反丁烯二酸在0.5～100μg/mL 浓度，琥珀酸在0.1～10μg/mL 浓度范围内线性良好（r2>0.99）。以3 倍信噪比作为检出限， 10 倍信噪比作为定量限。结果显示苹果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的仪器检测限分别为0.16 μg/ml 和0.16 μg/ml和0.045μg/ml; 对应的方法定量限为0.5 μg/ml 和0.5 μg/ml和0.1μg/ml。 　　3.2 回收率和批内精密度 选择水洗脱部位为加样回收率的样品，分别在样品中加入含有苹果酸，反丁烯二酸和琥珀酸86.5，356.9，1.0μg的样品溶液，每个浓度制备两份样品，计算加标回收率和精密度，结果见表3。如表2所示，苹果酸加标样品的平均回收率分别为94.2%、反丁烯二酸为91.8 %，琥珀酸为95.4 %， 相对标准偏差分别为3.2%、4.4%和3.7%， 结果证明该方法具有较好的回收率和精密度。
　　3.3 汉桃叶不同洗脱部位有机酸含量的测定 对分离富集得到的汉桃叶不同提取部位中苹果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的含量进行测试，结果表明苹果酸和反丁稀二酸在水洗脱部位中的含量较高，为4.32mg/g和17.84mg/g。而琥珀酸在各部位中含量均较少，均小于0.1mg/g。
　　4 结论
　　本文首次建立了利用UPLC-MS/MS靈敏、准确的测定汉桃叶不同部位中苹果酸、反丁烯二酸和琥珀酸含量的方法。方法在负离子模式下，应用多反应离子检测，得到苹果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的定量限分别为0.5 μg/ml 和0.5 μg/ml和0.1μg/ml。应用此方法，苹果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的回收率91.8～95.4%， 满足方法学要求。本文应用此方法对汉桃叶不同部位中有机酸的含量进行测试，发现水洗脱部位中有机酸含量较高，为汉桃叶药效部位的确定提供依据。
　　参考文献
　　[1] 上海中药一厂技术组， 汉桃叶有效成分的研究， 中成药研究， 1978， 3， 6-11.
　　[2] 中国药典（2015年版一部）. 北京： 化学工业出版社， 2015： 812.
　　[3] 徐杰， 汉桃叶的化学成分研究， 湖南中医药大学硕士学位论文， 2006.
　　[4] 潘力，廖厚知，齐艳辉，HPLC测定汉桃叶中反丁烯二酸的含量，辽宁中医杂志，2012， 39（5）：906-907
　　[5] 倪开勤，高效液相色谱法测定汉桃叶中有效成分含量，医药导报， 2013，32（8）： 1097-1098.
　　[6] 徐剑， 张永萍， 汉桃叶药材含量测定方法的研究， 贵阳中医学院学报，2008，30（2）： 75-77
　　[7] 胡书平，汉桃叶有机酸类成分研究及软膏剂开发，中央民族大学硕士学位论文， 2012.
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