流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展
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作者:夏天爽
摘 要：流式细胞术作为食品微生物质量检测的一种手段，不仅能够在功能水平上对食品中的微生物进行多参数、快速定量分析和纯化分选，还可以对食品中微生物的物理或化学性质进行测量。因此，本文从微生物在食品中的危害、流式細胞仪的基本结构与工作原理、流式细胞术在食品微生物检测中的应用这3个方面综述了流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展，期望为食品中微生物快捷、准确检测的实际应用提供理论参考。
关键词：流式细胞术 食品 微生物 检测
前言
流式细胞术是集现代物理电子技术、激光技术和计算机技术于一体的先进细胞分析技术，具有检测速度快、检测指标多、采集数据质量高、分析全面、分选纯度高和分选灵活等特点[1]。目前，流式细胞术已广泛应用在临床医学、食品安全、海洋生物基础科学研究等众多行业，特别是在食品微生物检测领域，流式细胞术已成为重要的检测手段之一，且呈现出良好的应用前景和发展趋势。因此，本文就流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展进行了综述。
1 微生物在食品中的危害
当前，食品中的微生物可分为3类——可用于生产的微生物、引起食品变质腐坏的微生物和食源性病原微生物[2]。其中，引起食品变质腐坏的微生物和食源性病原微生物是导致食品安全问题的主要原因，且此类微生物能够对人类机体造成直接的毒性作用——产生过敏反应或导致肠道腹泻，严重威胁人体健康。如2011年发生于德国的“毒黄瓜”事件，因其迅速席卷欧洲和美国，一度让人们陷入恐慌，而此次疫情是由出血性大肠杆菌污染所引起，最终造成了12个国家近3000人感染，30多人死亡[3]。因此，加强食品中微生物的检测不仅有助于防止微生物指标不合格的食品流入市场，还能保障食品的安全，满足人们对绿色食品的需求。
2 流式细胞仪的基本结构与工作原理
流式细胞仪的基本结构主要由4部分组成，即流动室与液流系统、光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统，其工作原理主要分为分选功能和分析功能。
2.1 流式细胞仪分选功能的工作原理
目前，流式细胞仪的分选功能主要由分选器根据所测定参数来完成。虽然其分选方式分为通道式分选和电荷式分选，但这两种分选方式都通过分离含有单细胞的液滴而实现。其中，流式细胞仪分选功能的过程为：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据所测定的参数由逻辑电路判定是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴进行充电，带电液滴携带细胞通过静电场时发生偏转，进入收集管路;未被收集的液体以废液的形式被处理[4，5]。
2.2 流式细胞仪分析功能的工作原理
当前，流式细胞仪分析功能的实现主要是通过3种信号来完成，即前向散射光、侧向散射光和荧光信号。前向散射光的大小与细胞直径成正相关，即细胞直径越大，前向散射光越大;细胞直径越小，前向反射光越小。侧向散射光的强度与细胞内颗粒结构的质量成正相关——细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，侧向散射光越大;细胞内颗粒结构越简单，质量越小，侧向散射光越小。而荧光信号的强度则与细胞膜表面抗原强度或细胞内物质的浓度有关[5，6]。
3 流式细胞术在食品微生物检测中的应用
就目前而言，流式细胞术在食品微生物检验中的应用主要可归纳为4个方面，即细菌计数、微生物活性的检测、食物中致病菌的检测、益生菌方面的应用。
3.1 细菌计数
食品中的细菌数量是判定食品受微生物污染程度的重要标志。目前，常规的细菌计数方法主要为活菌测定法和直接计数法。其中，活菌测定法主要包括平板计数、涂抹法、滤膜法和MPN法;直接计数法主要包括自动菌数测定仪和计数板计数法。但是，以上常规计数方法都存在一定的局限性，例如，细菌培养受特定培养基和培养条件限制，死菌和受伤菌不能在检测培养基上形成菌落，进而导致无法计数。与常规的细菌计数方法相比较，流式细胞术在进行细菌计数时，不仅无需使用培养基对细菌进行培养，还能对受伤菌和死菌进行检测。Van Nevel S等[7]利用流式细胞术对饮用水中的微生物进行常规评估，发现流式细胞术可快速准确地对饮用水中的细菌丰度进行量化。孙芝杨等[8]研究发现，流式细胞术能消除乳制品中蛋白质、体细胞和脂肪的干扰，并可快速准确地检测乳制品中的细菌总数。综上所述，流式细胞术为食品微生物检测中的细菌计数提供了新的思路。
3.2 微生物活性的检测
在食品的生产过程中，对可用于食品生产的微生物、引起食品变质腐坏的微生物和食源性病原微生物的活性进行检测，不仅能有效评价益生菌等产品的质量，还可有效评价食品的灭菌效果。姜凯[9]通过研究发现，流式细胞术能够检测发酵乳制品中乳酸菌的活菌数量，进而评价发酵乳制品中的乳酸菌含量。张波等[10]通过研究发现，流式细胞术可用于啤酒酵母生长的检测，且该方法快捷、可靠。综上所述，流式细胞术可广泛应用于微生物活性检测当中。
3.3 食品中致病菌的检测
食品在原料、生产、储藏、运输和销售等各个环节常常与土壤、水、操作人员、加工设备和包装材料等发生不同方式的接触，进而容易引起微生物污染，并导致食源性疾病的爆发。目前，随着人们对绿色食品要求的不断提高，卫生监管力度的不断加强，食品中微生物的检测方法也在不断完善。流式细胞术作为生命科学领域研究的先进技术，已成功应用到食品中大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和单增李斯特菌等致病菌的检测之中。Williams A J等[11]基于流式细胞术建立了一种检测菠菜中大肠杆菌O157：H7的新方法，经研究发现，新建立的方法优于传统的细菌分析方法。黄韵[12]采用流式细胞术对冷鲜肉中的单增李斯特菌进行检测，并与平板计数法、PMA-qPCR技术进行比对，经研究发现，流式细胞术优于平板计数法和PMA-qPCR技术。流式细胞术之所以能够快速准确地检测食品中的致病菌，主要是因为致病菌经过荧光染料处理后，在特定波长激发光的激发下会产生荧光，并被流式细胞仪的信号收集与转换系统收集，进而特异性的检测致病菌。 3.4 益生菌方面的应用
益生菌作为一类能够定植于人体肠道和生殖系统内的有益微生物，不仅能够促进人体肠道微生态的平衡，还可提高人体对细菌病毒感染的抵抗能力。郑亦舟等[13]研究发现，流式细胞术可快速地对市场上含有保加利亚乳杆菌饮料中的活性菌进行有效的实时监测。杜耿记等[14]应用流式细胞术建立了一种酸奶中乳酸菌含量的快速检测方法，发现该方法可大幅度缩短培养时间，且准确率较高。综上所述，流式细胞术不仅可对含有微生物的食品进行有效的监测和放行，还有助于食品企业对产品进行自查、自检。
4 结语
流式细胞术可直接对部分食品中的微生物进行检测，这不仅能够极大缩短检测时间，且获得检测结果的准确率较高。此外，随着流式细胞仪产品的不断更新，流式细胞术对细胞的计数和识别等已实现多参数、多色荧光分析，且应用范围愈发广泛。但流式细胞术在食品微生物检测过程中也存在一定的局限性和欠缺，如食品中含有不同的基质，且成分复杂，而流式细胞仪只能对细胞或生物颗粒乃至具有可溶性的生物分子進行直接的检测和分析;食品中含有的不同基质需要不同的荧光染料进行标记，但标记后的不同基质存在荧光信号重叠现象，而重叠区域越大荧光信号检测的准确性越低;部分待检查的食品细胞或生物颗粒自身大都携带基础荧光，而这些基础荧光的存在可能对检查结果造成干扰;流式细胞术在检测食品微生物时，其中的荧光染料能够使食品中的基质出现特异性荧光，而荧光染料具有一定的局限性，不能满足食品中复杂基质的检测等。
参考文献：
[1] 梁智辉，朱慧芬，陈九武.流式细胞术基本原理与实用技术[M].华中科技大学出版社，2008.
[2] 张新武，杜小波，徐素玲，等.食品中微生物危害的分析和控制[J].食品安全质量检测学报，2014（10）：3295-3299.
[3] 李乾学.大肠杆菌超突变子产生的分子基础及其在耐药性发生和转移中的作用[D].长春：吉林大学，2007.
[4] 吴后男.流式细胞术原理与应用教程[M].北京大学医学出版社，2008.
[5] 王书奎，周振英.实用流式细胞术彩色图谱[M].第二军医大学出版社，2004.
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[7] Van Nevel S， Koetzsch S， Proctor C R， et al. Flow cytometric bacterial cell counts challenge conventional heterotrophic plate counts for routine microbiological drinking water monitoring[J]. Water Research， 2017， 113：191-206.
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[9] 姜凯.基于流式细胞术的乳酸菌快速计数方法研究和活性判定[D].上海市：上海师范大学，2018.
[10] 张波，陈君，卢启威，等.应用流式细胞术对啤酒酵母在含油酸培养基中生长的定量研究[J].现代仪器，2008（02）：19-23.
[11] Williams A J， Cooper W M， Summage-West C V， et al. Level 2 validation of a flow cytometric method for detection of Escherichia coli O157：H7 in raw spinach[J]. International Journal of Food Microbiology， 2015， 215：1-6.
[12] 黄韵.冷鲜肉中单增李斯特菌活菌分子检测技术研究[D].广州市：华南理工大学，2014.
[13] 郑亦舟，王杰，刘洋，等.基于流式细胞术的保加利亚乳杆菌活性检测方法的应用研究[J]. 食品安全质量检测学报，2019，10（03）：33-36.
[14] 杜耿记，金珠，吴小慧，等.流式细胞仪快速检测酸奶中乳酸菌含量[J].食品安全质量检测学报，2017（07）：450-454.
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