诃子提取物制备溶剂的选择实验研究

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　　【摘要】　目的 利用组织破碎提取的方法优选出制备诃子提取物的最佳提取溶剂。 方法 以总丹宁的含量、诃子酸及诃黎勒酸的含量、浸出物的收率为指标对70%丙酮、70%乙醇和水进行优选。 结果 确定提取溶剂为70%丙酮。 结论 优选出的诃子提取溶剂具有可行性。
　　【关键词】　诃子提取物；组织破碎提取；总丹宁；诃子酸；诃黎勒酸 Study of the extraction solvent for Terminalia chebula Hydroscopicity ZHANG Zhengwei（Luoyang City Center Hospital,Luoyang 471000,China）
　　【Abstract】　Objective Using smashing tissue extraction to optimize the extraction solvent of Terminalia chebula．Methods The extraction solvent of Terminalia chebula was optimized from 70% acetone 、70% alcoho1 and water by the amount of the total tannins 、the chebilinic and the chebulanic, the rate of soft extract．Results The diterminated extraction solvent Was 70％acetone．Conclusion The extraction solvent is reliable and Appropriate for the Industrial production.
　　【Key words】　abstraction of T. chebula, smashing tissue extraction, fingerprinting, total dannins,chebilinic, chebulanic
　　诃子为使君子科榄仁属植物诃子(Terminalia chebula Retz.)及其变种绒毛诃子(T.chebula.var.tomentella Kurz.)的干燥成熟果实。它是一味常用收涩中药，具有涩肠止泻、敛肺止咳、降火利咽、调和药性、解毒等功效，临床应用广泛[1]。现代研究诃子具有抗氧化、抗菌、抗病毒、强心、抗诱变以及抗癌、抗阿米巴原虫、抗动脉粥样硬化以及强心作用等药理作用[2]，诃子果实中丹宁的含量为23.6-37.36%[3], 其药理作用主要集中在丹宁类成分 。大量研究证实诃子酸 （chebulinic acid）、诃黎勒酸 （chebulagic acid）是诃子中的主要有效成分和特征性成分[4]，其中诃子酸对实验动物具有显著的止咳祛痰、抗炎症渗出、止泻和抗氧化等作用。
　　本试验选用组织破碎提取的方法，以总丹宁的含量、诃子酸、诃黎勒酸的含量以及浸出物的收率为指标，优选出制备诃子提取物的最佳提取溶媒。为工业生产提供科学依据从而使诃子提取物更好的发挥其应有的治疗作用。1　 材料与仪器1.1　仪器　Waters detta 600高效液相 ，包括、四元泵、岛津UV-2201型紫外可见分光光度计；FA2004A型电子分析天平；梅特勒AE240型电子分析天平；闪式提取器（JHBE-50A，北京金鼐科技发展有限公司）；85-2恒温磁力搅拌器（金坛市杰瑞尔电器有限公司）。1.2　试剂：诃子酸、诃黎勒酸对照品为刘延泽教授提供，并经光谱鉴定、HPLC检测纯度均在95%以上；鞣酸对照品（Tannic Acid，分析纯AR，天津市福晨化学试剂厂）；干酪素（Casein,生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂）；Folin试剂（钨酸钠50g，加85%磷酸40ml和蒸馏水375ml，混合，加热回流3h，冷后加水稀释至500ml，避光保存）【5】； 0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH5.0） 1.3　药材来源　诃子药材采自广西壮族自治区中医药研究所植物园，由河南中医学院陈随清教授鉴定为使君子科植物诃子（Terninalia chebula Retz.）。2　实验方法与结果2.1　总丹宁的含量测定2.1 .1　总丹宁含量测定中标准曲线的绘制　精密称取恒重（80℃干燥2h）的鞣酸对照品50.10mg，加30%甲醇水溶液溶解并100ml棕色容量瓶定容，摇匀的溶液Ⅰ；精密吸取溶液Ⅰ1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml置于5个10ml棕色容量瓶中，分别加30%甲醇水溶液4.0，3.0，2.0，1.0，0ml，然后加0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH5.0）至刻度，摇匀，得溶液Ⅱ；分别精密吸取溶液Ⅱ1.0ml于10ml棕色容量瓶中，分别加Folin试剂0.5ml，摇匀，再加1.5%NaCO3溶液至刻度，显色20min后用1cm的比色皿，以蒸馏水作空白对照，在720nm处测定吸光度。以吸收度为横坐标，溶液浓度为纵坐标数据经回归处理得回归方程：C=55.044A-5.149,r=0.9999（见图1），表明鞣酸在5.01-25.05ug/ml浓度范围内与吸收度有良好的线性关系。
　　图１ 鞣酸标准曲线2.1.2　样品液的制备：称取诃子均匀碎块10.00g(MP2002电子天平)3份，分别加蒸馏水、70%乙醇、70%丙酮100ml浸泡15min，组织破碎提取3次（10、8、6倍量溶剂），每次提取时间为1min，合并滤液即得液Ⅰ。2.1.3　样品的测定：取样品的液Ⅰ中精密量取30ml，挥干后用30%甲醇定容于100 ml棕色容量瓶中，再取2ml置于25ml容量瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液10ml，30%甲醇定容。得到液Ⅱ，从液Ⅱ中取10ml加入已经放有700mg干酪素的具塞的锥形瓶中，磁力搅拌吸附60分钟，过滤得到液Ⅲ，分别精密吸取溶液Ⅱ和Ⅲ1.0ml于10ml棕色容量瓶中，照“2.1.1”项下的方法自“分别加Folin试剂0.5ml”起，依法测定吸光度，记为 A1 、A2，得ΔA=(A1-A2)，消除干酪素的空白干扰后代入线性方程中得C，计算样品中总丹宁的含量，平行测定三次，计算平均值。2.2　诃子酸、诃黎勒酸的含量测定2.2.1　色谱条件 色谱柱：SunfireTM (4.6×150mm)色谱柱，流动相：二元梯度洗脱，A：甲醇；B：0.5%醋酸，柱温：30℃，流速：1ml・min-1， 检测波长：254nm 2.2.2 线性范围　分别准确称取诃子酸、诃黎勒酸对照品0.97，1.00mg，各置于1mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成对照品溶液。分别吸取对照品溶液，依次进样5,10,15,20,25μl，作HPLC分析。以峰面积(X)为横坐标，成分含量(Y)为纵坐标，得回归方程、相关系数及线性范围，见表1。
　　表1
　　诃子酸、诃黎勒酸的线性关系2.2.3　样品溶液的制备 精密量取不同提取溶剂得到的滤液10 ml，挥干溶剂，以70%丙酮定容于500 ml容量瓶中，精密吸取提取液100 ml，于60℃减压浓缩至5 ml，上ToyopearlHW-40柱(1cm，柱长20cm，吸附剂高10cm)进行低压柱层析，依次用蒸馏水50 ml、5%甲醇50 ml洗脱除去杂质，然后用甲醇-丙酮-水(6∶2∶2)300 ml，洗脱(至洗脱液FeCL3-铁氰化钾薄层显色反应为阴性)，所得洗脱液于60℃减压浓缩至干，用甲醇溶解并定容于5 ml容量瓶中，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液进样5~10ul进行HPLC分析。

2.3 　实验结果以及处理
　　见下各表
　　表2
　　不同提取溶剂实验结果
　　表3
　　不同提取溶剂实验结果分析
　　注：（Y=0.4A+0.4B+0.2C）3　结果分析
　　由表2可以分析，不同提取溶剂所得总丹宁的含量依次为70%丙酮>70%乙醇> 水，诃子酸与诃黎勒酸的含量依次为70%丙酮>水> 70%乙醇，浸出物的收率由高到低依次为 70%丙酮>70%乙醇>水。
　　由表3综合评分结果经spss13.0软件组间t检验分析证明，两两之间均有显著性意义（P<0.05）。也即说明70%丙酮为三者当中的最优提取溶剂。4　讨论 4.1　目前国际上的报道丹宁的提取多用70%丙酮，结合工业生产和制剂开发的需要，选择工业生产常用的提取溶媒包括70%乙醇和水与70%丙酮进行比较，综合考虑选取最终的提取溶剂。4.2　本试验采用罗文毓等设计的改良的干酪素法测定鞣质的含量，该法干酪素能选择地结合有生理活性的鞣质，因此测出的是有疗效的鞣质，而无疗效的鞣质（如鞣质的氧化产物等）则不被测定，因此避免了测定方法对结果的影响。4.3　诃子中的有效成分丹宁为多羟基化合物，该类成分在光照和高温条件下不稳定，极易发生结构降解，成分稳定性差的特点限制了它的制剂开发，限于诃子中成分不稳定的障碍，在对诃子中的丹宁成分进行提取时，应控制好提取的温度和时间，力求快速、完全，以达到不破坏丹宁类成分之目的。组织破碎提取法在该方面体现出了极大的优越性，同时与传统的提取方法相比，又具有使用范围广泛、高效节能、操作简便、利于环保以及适用于工业化生产的优点[6]。从而选用组织破碎提取法作为制备诃子提取物的方法。参考文献[1] 中药大辞典(上册)[M],上海科技出版社, 2006.3 第二版,1641.[2] 肖云峰，刘小雷等.诃子的药理作用研究进展[J].北方药学,2011，8（11）:19-20.[3] 常新全、于丽霞主编. 中药活性成分分析手册（上）[M] 北京学苑出版社, 2006,6,1133.[4] 丁岗，刘延泽.不同来源诃子中三种可水解丹宁的定量分析[J]. 中药材,2000,23（6）:329-331.[5] 罗文毓，张育中.大黄中鞣质测量方法的研究[J].药物分析杂志，1986，6（1）：5. [6] 刘延泽. 植物组织破碎提取法及闪式提取器的创制与实践[J]. 中国天然药物，2007,5（6）：401-407.作者简介：张正伟，男，（1976-） ，汉族，河南洛阳人，主管药师，执业中药师，药物化学硕士

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