微生物治理海洋石油污染研究进展

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　　摘要    微生物降解石油污染作为一种新型环保的生物修复技术，已受到越来越多的人重视。本文对微生物治理海洋石油污染的机理以及工艺技术进行了综述，对微生物降解机制及有关直链烷烃的降解、支链烷烃的降解、芳香烃的降解、多环芳烃的降解、环化烃的降解等进行了详细阐述，并对影响微生物降解石油的影响因素如温度、营养盐等进行了探讨，以期为利用微生物治理海洋石油污染提供参考。
　　关键词    海洋石油污染;治理;微生物降解
　　中图分类号    X55        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）03-0175-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Research  Progress  on  Microbial  Treatment  of  Marine  Oil  Pollution
　　LIANG Jia-ling 1    CHEN Min 1    TANG Lan 1    GAO Guo-fu 2 *    WEI Bao-yang 1，3    OU Xiao-ming 3
　　（1 College of Biological Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128; 2 Hunan Institute of Agricultural Information and Engineering; 3 Hunan Ouhe Environmental Protection Technology Co.，Ltd.）
　　Abstract    As a new kind of environmental protection bioremediation technology，microbial degradation of oil pollution has been paid more and more attention to.In this paper，the mechanism and process technology of microbial treatment of marine oil pollution were reviewed.The mechanism of microbial degradation was elaborated in detail，including branched alkanes degradation，linear alkanes degradation，aromatic hydrocarbons degradation，polycyclic aromatic hydrocarbons degradation and cyclic hydrocarbons degradation，etc.The influencing factors such as temperature and nutrient salt were analyzed，so as to provide references for treatment of marine oil pollution by microbial degradation.
　　Key words    marine oil pollution;treatment;microbial degradation
　　海洋石油污染是指石油在開采、运输、精炼和使用过程中泄漏至海洋环境造成的污染，给海洋生物与环境带来了不可忽视的巨大灾害。据估计，全世界每年由径流携带入海洋的石油污染物约为500万t。石油进入到海洋之后，一部分分散于海水中被降解，一部分溶于海水形成石油薄膜，剩余部分在海浪的作用下扩散形成焦油团块[1]。残余的石油污染物长期存在于海洋的各个部分，对海洋生态系统有着灾难性的影响。海洋石油污染不但影响海洋藻类的生命活动能力及生长发育，严重制约海洋动物的生长与繁殖，甚至直接致其死亡[2]，对海洋乃至整个生态系统产生巨大影响;而且由于油膜覆盖在海水表面，阻碍海水与大气之间氧气和二氧化碳气体的交换和吸收，破坏海洋水体中溶解气体的循环平衡[2];此外，海洋石油污染会间接加剧“温室效应”，提高厄尔尼诺现象发生频率，加重“全球问题”[3]。有研究表明，赤潮在石油污染较为严重区域的发生概率与其他区域相比也较高，极端气候现象逐渐增多，为各地区的环境和经济等各方面都带来了负面影响。海洋石油十分容易聚集于海岸，对海滩等自然景区造成污染，在一定程度上影响了滨海城市形象，限制了城市旅游业的发展。本文对微生物处理海洋石油污染研究进行了综述，旨在探明微生物对油类污染的修复因素和影响，为改善海洋水体水质提供参考。 　　1    治理海洋石油污染的主要方法
　　1.1    吸附法
　　吸附法指使用高性能的吸油剂吸附海面的石油，从而达到清除海面油污的目的。其具体过程：先将吸油剂投至受到石油污染的区域，吸油剂成功吸附海面石油后，再将吸油剂收集并进行集中清理。目前，已有科学家用稻壳制成一种活性炭吸油剂，将其命名为ASSW。该吸油剂无需添加任何中和油制的化学制品，且其制作成本仅为其他普通吸油剂的1/10;试验研究证明，1 kg ASSW能吸附6.8 kg油和水，吸附力极强且不会对海洋造成二次污染[4]。
　　1.2    燃烧法
　　燃烧法简便易行，只需要对海面石油进行焚烧即可。但是，该方法只能清除石油中的可燃部分，燃烧的同时将会造成二次污染，即在海水中留下更加难以处理的石油残留黏稠物质;燃烧过程中会产生大量烟雾，对大气层造成破坏，同时也会对空气造成一定程度的污染[5]。
　　1.3    化學分散法
　　化学分散法指采用由溶剂、助溶剂、渗透剂和表面活性剂等共同组成的分散剂清除石油，该分散剂为均匀分布的透明液体。溶剂是表面活性剂的载体，可以扩散海水中的石油;表面活性剂则可以将石油分解成易被海洋微生物吞食的小液滴，这些小液滴被潮水冲散后，分散在海洋表面以及近表面的水域，被海洋微生物吞食，最终被分解成CO2和其他水溶性物质[6]。但此方法的不足之处是其在清除海面油污的同时会对鱼类等海洋生物的生长发育及繁殖造成影响，并且其降解速度较慢。
　　1.4    微生物降解法
　　微生物降解法是指存在于自然界中以石油为主要碳源的微生物对石油污水中有机物进行降解，达到降解石油的目的[7]。海洋的元素循环和物质转化离不开海洋中各种微生物的共同作用，海洋中存在的石油降解细菌通过降解海洋石油来完成碳素循环，从而减少石油污染。在自然环境中，细菌、真菌、酵母菌、霉菌都能参与石油中烃类物质的降解，在海洋中细菌和酵母菌为参与反应的主要降解菌。微生物的降解速度与油的运动、分布、形态和体系中的溶解氧含量、温度、营养物质等因素有关。微生物吞噬法降解迅速、无残毒、低成本;但当微生物在配合使用化学药品除油时，其生长、繁殖会受化学药品的抑制。为了减小微生物对当地生态系统的影响，应当按需求选择适当的菌种[8]。在长期受石油污染的地区或海域，富有以石油为营养物质的微生物菌群，通过驯化或诱导等手段得到目的菌株，可以将这些微生物用于海洋石油污染的治理。海洋污染的生物修复技术就是由此发展而来。
　　2    微生物治理石油污染
　　2.1    微生物治理石油污染的研究
　　20世纪70年代中期，有学者培育出了一种“超级石油菌”，该细菌能够降解石油原油中的大部分烃类，为海洋石油污染的治理带来了新希望，但这种细菌的性质不稳定，引入实际应用还需继续研究[9]。1989年，美国首次将生物修复技术大规模投入使用，开创了微生物修复技术治理石油污染的前例，获得了成功[10]。20世纪90年代，英国采用加入细菌和营养盐混合培养物进行了海上消除油膜的试验，这是首次在不使用拦油栅及化学药剂的情况下处理石油污染。结果显示，该混合物在短时间内将石油分子转化成脂酸乳状液，且降解生成物不会对水体产生不良影响，即不产生二次污染[9]。1991年，美国运用菌剂Alpha BioSeaTM成功修复了德克萨斯州溢油污染海岸线，日本运用菌剂Tera-ZymaTM修复重质原油污染场地等均取得了成功[11]。1992年以色列开发了一种只被石油降解菌利用的肥料，在微生物修复石油污染方面发挥了有效作用[11]。2011年，周  瑜等[12]研究发现，分离出的石油降解菌与从污水入海口分离到的微藻共同培养时的降解率比单独培养时高，表明利用微藻-细菌共生法促进细菌降解石油在生物修复方面具有很好的应用潜力。2012年，郑  立等[13]研制了基于石油降解菌群DC10的降解菌剂，用于大连溢油岸滩生物修复试验，通过分析C17/藿烷、C18/藿烷、总烷烃和总芳烃的降解率来评价其降解效果。在为期12 d的潮间带油污生物修复试验中，喷洒菌剂处理的C17/藿烷、C18/藿烷、总烷烃和总芳烃的降解率相对自然风化处理有显著的提高。2016年，吴秉奇等[14]构建出了石油降解复合菌系SQ1，该复合菌系在海洋石油污染修复中具有较强的应用潜能。2019年，张  美等[15]首次发现并报道了能够降解石油的Vagococcus属菌株，为开展海底石油污染物的厌氧修复奠定了研究基础。
　　2.2    可用于治理石油污染的微生物种类
　　目前，已经发现100多属200多种石油降解菌，其中细菌79种、蓝细菌9种、真菌103种和海藻19种[16]。在长期的石油污染驯化过程中，海洋中出现了一类以石油为主要碳源生长繁殖的“噬石油烃”细菌[17]，有以多环芳香烃为碳源的解环菌属（Cycloclasticus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、盐单胞菌属（Halomonas）、海杆菌属（Marinobacter）、海旋菌（Thalassospira）、海茎状菌（Maricaulis）、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas），还有以饱和烷烃、支链烷烃为碳源的食烷菌属（Alcanivorax）;以脂肪族烃、烷醇和链烷酸酯的油螺旋菌属（Oleispira）、嗜油菌属（Oleiphilus）;还有降解荧蒽的速生杆菌属（Celeribacter）。
　　能够降解石油烃的真菌主要是霉菌和酵母菌。其中，真菌包括真菌类的金色担子菌属（Aureobasidium）、假丝酵母属（Candida）等;霉菌类的青霉素（Penicillium）、曲霉属（Aper-gillus）等以及酵母菌类的红酵母菌属（Rhodotorula）、毕赤氏酵母菌属（Pichia）等[16]。酵母菌在自然界中分布十分广泛，在油井、油田附近尤为突出，可找到许多利用烃类物质为碳源生长的酵母菌，经过富集、筛选、培养后可用于处理受到石油污染的废水[18]。 　　2.3    微生物降解海洋石油的机理
　　2.3.1    直链烷烃的降解过程。多数学者研究认为，直链烷烃通过氧化酶系统的酶促反应进行生物降解。直链烷烃先被氧化酶氧化成相应的伯醇，醇在脱氢酶的催化下被氧化成相应的醛，醛再转化为脂肪酸。主要有3条氧化途径，即单末端氧化、双末端氧化和次末端氧化。醛转化为相应的脂肪酸后，其中一种转化形式为直接进行β-氧化，而另一种转化形式即脂肪酸进行ω-羟基化转化为ω-羟基脂肪酸，而后在非专一羟基酶的参与下将ω-羟基脂肪酸被氧化为二羧基酸，最后再进行β-氧化序列。脂肪酸通过氧化作用生成乙酰辅酶A，继续进入三羧酸循环，经过一系列酶的催化后最终生成二氧化碳和水，释放出能量或进入其他生化过程[19]。
　　2.3.2    支链烷烃的降解过程。相比于直链烷烃，降解支链烷烃的过程要更为复杂，且支链的存在会增加微生物降解石油的阻力。因為烷烃的主要氧化分解部位在直链上，所以靠近支链的一端较难发生氧化反应。带支链烷烃的降解过程主要是通过α-氧化、ω-氧化或 β-碱基去除途径完成[20]。因此，烷烃的支链降低了微生物的降解速率，即含有支链结构的烷烃的分解速率比相同碳数的直链烷烃低[21]。
　　2.3.3    环烷烃的降解过程。环烷烃的生物降解原理与烷烃物质类似，也是末端氧化[22]。环烷烃被各种氧化酶氧化为与之相应的醇后，通过脱氢酶转化为相应的酮，然后再被氧化为酯酶或脂肪酸。环己烷的转化过程为先被氧化成环己醇，继而被氧化为环己酮，最后转化为脱氢酶和脂肪酸，再形成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，最终生成水和二氧化碳，同时放出部分能量。
　　2.3.4    芳香烃的降解途径。苯环首先被苯双加氧酶氧化成顺式苯二氢二醇，再在顺苯二醇双加氧酶的作用下转化为中间体邻苯二酚，邻苯二酚可以进行邻位切割与间位切割等2种过程，继而进入三羧酸循环[23];芳香烃的降解途径与苯环类似：先形成邻苯二酚或其衍生物的共同代谢中间体，再经开环反应形成对应的直链分子，最后进入TCA循环[24]。真菌和细菌中的部分种类可以降解芳香烃，但是它们的降解途径和内部的反应机制机理不尽相同。以细菌为例，芳香烃是被2个氧原子氧化并转化为多环芳烃;真菌则是将芳香烃氧化为反式二氢二醇[25]。
　　2.3.5    多环芳烃的降解途径。多环芳烃可以在相应酶的催化下被降解为2种中间产物，即乙二醇和邻苯二酚基团，然后进一步被分解为乙酰CoA或琥珀酸[26]。酵母菌和细菌降解多环芳烃的过程也存在着明显差异。在酵母菌的作用下，多环芳烃通过单加氧酶氧化成环氧化物，继而进一步生成反式二醇，在环化水解酶的催化下生成反式二氢2-苯酚;在细菌的作用下则是通过双加氧酶氧化形成环氧化物，继而进一步生成顺式二醇，在环化水解酶的催化下形成顺式二氢2-苯酚。2条途径最终都生成二氧化碳和水。在反应过程中，多环及杂环破裂是杂环化合物和多环芳烃降解的主要限速步骤。多环芳烃难以被降解，限制因素主要为物质本身的溶解性、取代基种类和数量、苯环数目及烃内所含杂环原子的性质[22]。
　　3    微生物降解石油的影响因素
　　3.1    温度
　　温度影响烃类的降解速率主要体现在2个方面：一是温度直接影响微生物自身的生长、发育、繁殖和生理代谢等生命活动过程，如体内反应酶的活性、细胞的增长和分裂生殖速度等;二是温度影响石油在海洋中的理化性质，间接影响海洋微生物对石油的降解和利用。温度增高，加强了石油中部分有害物质的挥发，促进了石油乳化成易被微生物所吞食的小颗粒，从而加速油类物质的利用和降解。
　　3.2    营养盐
　　在石油降解过程中，由于石油提供微生物生长生活所需要利用的大量碳源，而周围的海洋环境中含有足够的无机物质和有机物质可供微生物生长和繁殖利用，氮和磷成为微生物降解的主要限速因子[27]。
　　3.3    氧含量
　　虽然有部分试验证明，在厌氧条件下，微生物也仍然能降解石油原油中的烃类，但在好氧条件下生物降解烃类的反应仍比在厌氧条件下活跃得多。据测量计算，微生物降解10 g石油所需要的氧气为30～40 g。而在石油污染严重的海域，因石油薄膜阻隔了氧气与海洋的接触，影响了海洋与大气之间的气体交换，导致水体的含氧量降低，从而影响了微生物的生长和代谢过程[22]。
　　3.4    陆源污染物
　　对美国Brittany海岸石油泄漏的研究发现，大量氮、磷肥进入海域后，为微生物生长繁殖提供了丰富的营养物质，因而该地区石油烃的生物降解速度比其他地区快;相反，农药则对微生物石油降解有限制作用[28]。
　　4    微生物治理海洋石油污染的方式
　　4.1    接种基因工程菌
　　土著微生物、外源微生物和基因工程菌等都可用于修复海洋石油污染。其中，土著微生物生长比较缓慢、代谢活性不高，故效果不明显。利用外源微生物修复环境时，可能会面临以下几种压力：需要修复的环境中，污染物可能存在一定的毒性;外源微生物与土著微生物之间存在种间竞争;外源微生物被引入到新环境，还需要时间适应新的生长环境。这几方面的压力会影响外源微生物的存活力或自身活性，限制外源微生物的高效应用。生物修复的发展，让一种特殊菌可实现同时降解多种类型石油烃，Chakrabaty及其同事在1976年首次将3个烃类降解质粒转移到一个铜绿假单胞菌中，培育出“超级细菌”，虽然该细菌的质粒存在一些不足，在实际应用中难以充分发挥其预期作用，但其已经成为利用细菌消除油污染技术方向的一个里程碑。在以后的研究中，有人采用生物技术将恶臭假单胞菌等菌类携带的各种质粒转入到一个铜绿色假单胞菌中，构成的“超级嗜油工程菌”清除油污的能力比天然微生物高10 000倍[29]。 　　4.2    使用表面活性剂
　　大部分表面活性剂是合成表面活性剂，它能够促进石油乳化，增加石油降解微生物和油珠的接触面积，加快石油烃类物质的降解。但其大部分来自不可再生资源的状况，可能会造成严重的生态污染，因而人们将视野转向了天然绿色的生物表面活性剂[30]。
　　4.3    使用氮、磷营养盐
　　在海洋出现溢油事故后，海水中有充足的碳源、微量元素及无机盐，因而限制石油降解的因素主要为氮、磷营养盐的供应。通常使用的营养盐有3种：缓释肥料、亲油肥料和水溶性肥料。缓释肥料具有适合的释放速度，在海潮的作用下可以将营养物质缓慢地释放出来[31]。亲油肥料可以使营养盐利用其脂溶性溶解于油而非水中，这样的营养盐可以促进细菌充分利用营养物质在油相表面生长[32]。水溶性肥料在开放的海水中容易快速溶于水而流失，因而可能产生富营养现象[33]。
　　4.4    提供电子受体
　　石油烃污染物降解的速度和程度受最终电子受体的种类和浓度影响[34]。海洋环境中具有分解石油烃污染物能力的微生物大多数为好氧微生物，因而氧气是限制微生物降解石油烃污染物的一个重要因素。投入使用时，可以通过一些物理、化学措施增加海水溶氧量，从而提高降解速率。有学者在澳大利亚对油污红树林进行生物修复试验时采用空压机供氧（流量为100 L/min），同时添加TM肥料，最终结果显示，供氧期间烷烃降解菌和芳香烃降解菌在数量上有大幅度增长[31]。
　　4.5    微生物固定化技术
　　固定化技术是指利用物理或化学手段将游离的微生物细胞、动植物细胞、细胞器或酶固定在一个特定的空间范围内，使其高度聚集并且保留其固有的活性可以在环境中连续和重复使用的技术。这种技术有很多优势，如微生物密度高、流失少、作用时间长、抗不良环境能力强等。另外，载体的某些因素会影响微生物的吸附固定，如碳质材料载体的比表面积、孔容积、孔径分布、表面官能团以及表面金属氧化物等[35]。张秀霞等[36]采用生物大分子仿生合成出的纳米SiO2为载体，制备出固定化微生物，将其应用于石油污染生物修复模拟试验中，结果显示，固定化微生物提高了石油污染物的降解率，并且通过多次重复降解试验结果证明，用固定化微生物技术构建的固定化微生物对石油污染物有着高效稳定的降解率。近年来，利用固定化微生物技术制成固定化微生物菌剂已成为修复治理海洋石油污染的一种有效的方法。
　　5    展望
　　目前，治理海洋石油污染已迫在眉睫，而利用微生物修复海洋污染已经引起越来越多学者的注意，也取得了许多令人瞩目的成果，但其中仍存在着许多不足，如修复效率低、微生物之间存在竞争等。研究过程中也面临着许多难题，如海洋面积庞大等。石油烃的微生物降解是一个较为复杂的过程，降解效率受各种因素的影响，如温度、营养盐、微生物种类、固定材料和周围环境参数等。由于降解过程的机制机理尚未研究透彻，该领域的研究仍需进一步拓展深入。再者，石油烃的组分复杂，需要多种微生物协同作用才可发挥更好的效果、提高降解效率。同时，对于“超级石油菌”的研究也应该继续深入，争取早日將其应用在石油污染的治理中，以造福自然和社会。
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