新疆野苹果资源遗传多样性SSR分析
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作者: 秦伟 沙红 刘立强 廖康 耿文娟 王云
摘 要：采用SSR标记技术对新疆野苹果7个天然居群180份样品进行了遗传多样性分析，旨在为新疆苹果的杂交育种及优良品种/品系的选育提供理论依据。13对SSR引物共扩增出119条多态性条带，各居群内的多态性位点比率为79.84%~92.25%；居群水平上新疆野苹果的遗传多样性变化趋势基本一致，其中新源居群的有效等位基因数（Ne）、Nei's基因多样性（H）和Shannon信息指数（I）在7个居群中最大；种级水平上的Shannon信息指数（I）为0.551 6，居群内为0.468 9；新疆野苹果居群的变异主要存在于居群内部，居群间和居群内遗传多样性分别为15％和85％，说明新疆野苹果居群的变异主要存在于居群内部。
关键词： 新疆野苹果； 种质资源； 遗传多样性； SSR
中图分类号：Ｓ６６1．1 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０（２０12）０2－0161－０5
SSR analysis for genetic diversity of Malus sieversii from Xinjiang， China
QIN Wei1，SHA Hong2，LIU Li-qiang1，LIAO Kang1*，GENG Wen-juan1，WANG Yun1
（1College of Forest Science and Horticulture， Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052 China； 2Economic Crop Research Institute， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi，Xinjiang 830091 China）
Abstract: In order to provide theoretical basis for crossbreeding and high-quality breeding， the genetic diversity of 180 Malus sieversii individuals from 7 populations in Xinjiang was investigated using SSR markers. 119 bands were amplified by thirteen pairs of SSR primers and the polymorphic loci (P) ratio among these populations ranged from 79.84% to 92.25%. At population level， the variation trend of genetic diversity of M. sieversii was consistent. The effective number of alleles Ne， gene diversity Nei’s and Shannon’s information indexes of Xinyuan population were the higherst among the seven populations. At species level， Shannon’s information index was 0.551 6， and 0.468 9 at populations level. The genetic diversity of intro-population and inter-populations were 15% and 85% respectively， which indicated that the aberrance of M. sieversii populations mainly occurred in inter-populations.
Key words: Malus sieversii (Ldb.) Roem.； Germplasm resources； Genetic diversity； SSR
新疆野苹果[Malus sieversii （Ldb.） Roem.] 别名塞威士苹果、天山苹果，维吾尔语和哈萨克语称牙瓦阿尔马，是第三纪残遗植物，已被列为中国优先保护物种名录，并被列为国家濒危二级保护植物。新疆野苹果是珍贵的果树种质资源，具有抗寒、耐虫、耐病和耐旱等优良性状。新疆野苹果适宜做栽培苹果的砧木，亲和力强，种源丰富，已成为西北地区及其他产区苹果主要砧木之一，为我国果树生产做出了重要贡献[1]。
目前，国内外一些学者对新疆野苹果资源遗传多样性做了大量研究，如李天俊等[2]通过过氧化物酶同工酶测定的结果表明，不同新疆野苹果种群之间存在明显的差异，同时也具有同源相似之处，同一种群之间差异不显著。Lamboy等[3]对采自中亚哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦和乌兹别克斯坦的实生苗进行同工酶分析，发现基因型间差异显著。Volk等[4]采用SSR技术对来自中亚43个半近亲系的591个单株进行遗传多样性分析发现，等位基因丰度在采样地之间差异显著，且各采样地均有一系列特有的等位基因。冯涛等[5]对新疆野苹果30个实生株系香味物质组分进行GC-MS分析，结果表明，各实生株系挥发性化合物总含量、各类挥发性化合物种类数及其含量，以及主要挥发性化合物分离比率与含量等存在广泛的遗传变异，参试的30个实生株系间差异明显，遗传多样性极为丰富。张春雨等[6]利用SSR技术对新疆野生苹果居群进行了遗传结构的研究，结果表明大部分遗传分化是由居群内部野生单株间差异造成的。
我们在前人研究基础上以新疆野生苹果7个天然居群180份样品为试材，利用SSR技术深入研究了新疆苹果种质资源的遗传多样性，旨在从分子生物学的角度分析新疆苹果不同天然居群间的亲缘关系，并进一步验证新疆野苹果的分子遗传特性，为新疆苹果的杂交育种及优良品种/品系的选育提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 植物材料
材料于2009―2010年在新疆维吾尔自治区7个不同天然居群共采集180份样品（采样居群地理位置见图1）。为保持采集样本的一致性，根据天然居群的规模，按照均匀分布，随机采样的原则，在每个采样点选择20~38个样本，单株间相距在50 m以上，具体采样点居群地理信息见表1。具体采样方法：对采样树体进行GPS定位，取新鲜幼嫩叶片5～10 g，加入 50～100 g变色硅胶，把干燥的样本材料带回实验室，在室温下保存即可。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 采用CTAB法[7]提取新疆野苹果基因组DNA，并进行DNA样品的浓度和纯度的测定。
1.2.2 SSR引物筛选 从7个不同天然分布居群180份样品中随机选取6个样本，自来源于苹果的80对SSR引物中初步筛选出35对有产物、主带明显的引物。每个居群再随机选取2个样本，共计14个样本，再从中复筛选出13对多态性较好的引物进行SSR分析。试验的试剂：MgCl2、dNTPS、TaqDNA聚合酶、DNAmarker（100～1 500 bp）均购自北京天根科技有限公司，80对SSR引物由上海生工生物公司合成。
1.2.3 SSR-PCR反应体系优化 SSR初始反应体系参照相关类果树的SSR-PCR的反应体系[6，8-10]。
新疆野苹果SSR-PCR初始15 μL反应体系包含：10 mmo・L-1 Tris-HCl（pH 8.3），50 mmol・L-1 KCl，1.5 mmol・L-1 MgCl2，0.20 mmol・L-1 dNTPS，正反引物各为1 μmol・L-1，0.5 U・μL-1 Taq DNA聚合酶，DNA模板30 ng，ddH2O；10 μL反应体系包含：10 mmol・L-1 Tris-HCl（pH 8.3），50 mmol・L-1 KCl，1.5 mmol・L-1 MgCl2，0.25 mmol・L-1 dNTPS，正反引物各为0.8 μmol・L-1，0.5 U・μL-1 TaqDNA聚合酶，DNA模板30 ng，ddH2O。
相应的扩增程序为：94 ℃预变性，4 min，94 ℃变性45 s，50~59 ℃ 复性45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
1.2.4 数据处理与分析 对电泳中稳定清晰的扩增片段赋值为1，无带为0，构建二元数据矩阵。用POPGENE version 1.32软件分析居群遗传多样性及遗传结构，利用NTSYS-PC软件进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 遗传多样性
遗传多样性的常用度量指标为居群多态性位点、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性（H）与Shannon信息指数（I）等。基因多样性不仅是衡量居群遗传多样性最常用的指标，同时也反映居群中等位基因的丰富度和均匀度。在新疆野苹果7个居群中，13对引物扩增多态性位点最高为伊宁居群，检测到119个位点，多态性位点百分率为92.25%。最低为霍城居群，检测到103个位点，多态性位点百分率为79.84%，说明各居群内的多态性处于较高水平按所检测的多态位点丰富程度，5个居群的排序为：伊宁（92.25%）>新源（91.47%）>额敏（91.47%）>巩留（90.70%）>裕民（89.15%）>托里（80.62%）>霍城（79.84%）（表2）。
从表2可知，各居群内的有效等位基因数介于1.482 1～1.617 9，其中新源居群最高，霍城居群最低。具体排序为新源（1.617 9）>巩留（1.599 2）>额敏（1.579 4）>裕民（1.538 8）>托里（1.532 4）>伊宁（1.505 0）>霍城（1.482 1）。Nei’s基因多样性指数（H）分析显示，各居群内Nei’s基因多样性指数变动为0.276 8～0.349 7，其中新源居群最高，霍城居群最低。7个居群的Nei’s基因多样性指数依次排列为新源（0.349 7）>巩留（0.343 2）>额敏（0.331 3）>裕民（0.311 6）>托里（0.303 6）>伊宁（0.298 6）>霍城（0.276 8）。Shannon信息指数（I）研究结果显示，不同居群内Shannon信息指数值的变化在0.411 9～0.512 9，其中新源居群最高，霍城居群最低。7个居群Shannon信息指数值的排序为新源（0.512 9）>巩留（0.505 7）>额敏(0.490 2）>裕民（0.490 2）>伊宁（0.451 0）>托里（0.447 2）>霍城（0.411 9）。
总体来看，新源居群无论是有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性（H）还是Shannon信息指数（I）在7个居群中都是最大值，由此可知在7个居群中新源居群的遗传多样性最丰富，因此在原位的种质资源保护计划中应优先考虑新源居群。此外，新疆野苹果种级水平的Shannon信息指数（I）为0.551 6，居群内为0.468 9，居群内遗传多样性等于居群内平均I值比种级水平I值。因此可得出：居群间和居群内遗传多样性分别占总遗传多样性的15％和85％，居群内遗传多样性大于居群间遗传多样性，即新疆野苹果居群的变异主要存在于居群内部（表2）。
2.2 遗传分化
新疆野苹果7个居群总基因多样性指数（Ht）为0.374 6，各居群内基因多样性（Hs）为0.316 4，遗传分化系数为0.155 3，基因流为2.719 2 （表3）。可见新疆野苹果居群内和居群间均存在一定的的遗传分化，新疆野苹果遗传多样性84.47%存在于居群内，15.53%存在于居群间，表明新疆野苹果的遗传变异主要来自于居群内部，少部分来自于居群间。
2.3 居群间的遗传相似度和遗传距离
遗传相似度和遗传距离是衡量居群间物种种源变异水平的重要指标，反映居群间的遗传分化程度和亲缘关系的远近。根据Nei（1978）遗传相似度（I）和遗传距离（D）无偏估计值（表4），居群的遗传相似度在0.835 7～0.973 9，其平均值为0.910 2；居群的遗传距离在0.026 4～0.179 5，其平均值为0.095 1。2者均表明居群间亲缘关系很接近，但也存在一定的遗传变异性，其中，裕民居群和额敏居群之间的遗传相似度最高，它们的居群遗传距离最小；霍城居群和托里居群之间遗传相似度最低，它们的居群遗传距离最大。由此可以看出，裕民居群和额敏居群亲缘关系最近，遗传分化程度小；霍城居群和托里居群亲缘关系最远，遗传分化程度大。
2.4 居群间遗传关系的聚类分析
为进一步探讨新疆野苹果种内和种间的遗传关系，对新疆野苹果的Nei's（1978）遗传距离进行UPGMA聚类分析，以分层聚类平均距离0.14为阈值（图2中虚线所示）可进一步分析居群间遗传关系。从居群间的聚类图显示（图2）：7个分布居群划分为3个类群，其中霍城居群、新源居群和巩留居群可聚为第1类，伊宁居群、额敏居群和裕民居群可聚为第2类，托里居群可以单独聚为第3类。总体来看，所分类别中各新疆野苹果居群间的亲缘关系较近。同时，从图中还可看出，额敏居群和裕民居群的遗传距离最小，亲缘关系近，霍城居群和托里居群遗传距离最大，亲缘关系较远。
3 讨 论
3.1 居群遗传多样性
居群的遗传结构揭示居群内部遗传变异的分布格局，有利于准确了解该居群的形成过程和机制[11]。通过衡量新疆野苹果不同居群的居群多态性位点、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性（H）、Shannon信息指数（I）、遗传分化系数（Gst）和基因流（Nm*）等，都可以看出新疆野苹果无论在居群水平还是物种水平都存在丰富的遗传多样性。与前人研究既有相同之处又存在一定差异，如在居群水平研究显示，新疆野苹果居群的变异主要存在于居群内部，此结论与前人研究结果基本一致；而新疆野苹果的遗传多样性以新源居群最高，霍城居群最小，此结果与张春雨等[6]认为的巩留居群遗传多样性水平最高，而新源次之的结论不同，其主要原因素可能与取样居群的具体地点和采样量有关。而分析新疆野苹果在物种水平物种水平和居群水平具有较高的遗传多样性原因认为，新疆野苹果作为一个自然的植物群落，长期以来主要依靠种子实生繁殖等一套固有的繁育体系来维持种群的繁衍和遗传平衡，它是造成新疆野苹果遗传多样性丰富的主要因素；其次是新疆野苹果根蘖繁殖对遗传多样性水平具有一定的维系作用。然而，近年来人类活动对新疆野苹果原生境干扰严重，造成新疆野苹果资源量急剧下降，部分优良遗传性状已流失，因此新疆野苹果资源保护和利用迫在眉睫。
3.2 居群的遗传变异与分化
由本研究中新疆野苹果遗传分化系数Gst为0.155 3分析可知，新疆野苹果的84.5%的遗传变异存在于居群内部，15.5%的遗传变异存在于居群之间，此研究结果与Lamboy、Volk、张春雨等[3-4，6]试验结论相符。根据Wright[12]对遗传分化系数的大小与分化程度的关系的规定，遗传分化系数介于0～0.05之间说明居群遗传分化很弱，介于0.05～0.15之间说明居群遗传分化中等，介于0.15～0.25之间居群遗传分化较大，大于0.25表明居群遗传分化极大。本研究中新疆野苹果居群的遗传分化系数均大于0.15，说明新疆野苹果居群的遗传分化较大。
基因流强弱对居群遗传分化具有重要影响。Loveless等[13]认为居群间基因流大于1，能发挥其均质化作用；小于1就不足以抵制居群内因遗传漂变而引起居群间遗传分化。新疆野苹果居群的Nm为2.719 2，远远大于1，则说明新疆野苹果的基因流传授无阻碍，新疆野苹果居群间存在适当的基因交流。居群间的基因流主要是由花粉或种子携带外来基因产生的[12]，而新疆野苹果是种子还是花粉影响基因交流，有待进一步研究探讨。
4 结 论
利用SSR标记技术对新疆野苹果居群进行了遗传多样性分析，可以得出以下几个结论： 1）从80对SSR引物中筛选出13对多态性明显引物用于PCR扩增，共检测出119个多肽位点，占92.25%。2）新疆新源居群有效等位基因数（Ne = 1.617 9）、Nei’s基因多样性（H = 0.349 7）还是Shannon信息指数（I = 0.512 9）在7个居群中最大。3）新疆野苹果居群的变异主要存在于居群内部，居群内的遗传多样性（85％）大于居群间的遗传多样性（15％）。4）裕民居群和额敏居群亲缘关系最近，霍城居群和托里居群亲缘关系最远。
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