水果及其制品中果胶含量的比色法测定条件优化

来源:用户上传      作者: 庞荣丽 张巧莲 郭琳琳 方金豹 谢汉忠 李君 罗静 吴丰魁

　　摘 要：为研究水果及其制品中果胶测定方法，以半乳糖醛酸为标准物质，对硫酸-咔唑比色法测定水果及其制品中果胶含量的比色条件如吸收波长、咔唑-无水乙醇溶液用量、硫酸用量、显色温度、显色时间、显色后稳定时间等进行了优化和系统研究。结果表明，最佳显色条件为在1.0 mL滤液中，加入0.25 mL 0.1%咔唑-无水乙醇溶液，迅速加入5.0 mL硫酸，在85 ℃水浴中加热20 min，自来水浴中冷却，显色后1.5 h内在525 nm波长条件下测定。在此条件下，标准曲线线性范围广、相关性良好，精密度和准确度高，均符合相关标准要求。
　　关键词： 果胶； 比色法； 硫酸； 咔唑
　　中图分类号：Ｓ６６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０（２０12）０2－0302－０6
　　
　　Study on the colorimetry determination conditions of pectin in fruits and derived products
　　PANG Rong-li1， ZHANG Qiao-lian2， GUO Lin-lin1， FANG Jin-bao1*， XIE Han-zhong1， LI Jun1， LUO Jing1， WU Feng-kui1
　　（1Zhengzhou Fruit Research Institute， CAAS/ Monitor & Test Center of Fruit and Nursery Stock Quality， the Ministry of Agriculture， Zhengzhou， Henan 450009 China； 2Department of Landscape & Horticulture， Xuchang Vocational Technical College， Xuchang， Henan 461000 China）
　　Abstract: In order to research the determination method of pectin content in fruits and derived products， coloring conditions of sulfuric acid-carbazole colorimetry including absorption wavelength， amount of carbazole-ethanol solution and sulfuric acid， temperature， reaction time， and stabilization time after coloring were optimized using galacturonic acid as standard substance. The results showed that the optimum coloring conditions were adding 0.25 mL 0.1% carbazole-ethanol solution and adding 5.0 mL sulfuric acid quickly to 1.0 mL filtrate， water bathing for 20 min at 85 ℃， cooling down quickly with running tape water bath， and measuring at 525 nm wavelength within 1.5 h after coloring. Under the conditions， it had wide linear range standard curve， good correlation， high precision and accuracy，and were in line with relevant standards.
　　Key words: Pectin； Colorimetry； Sulfuric acid； Carbazole
　　果胶广泛分布于水果、蔬菜等植物中，未成熟果实内的原果胶在细胞壁内与纤维素和半纤维素结合在一起[1]，不溶于水。当果实成熟时，原果胶变为可溶性果胶[2]，能溶于水，但不溶于乙醇和乙醚。新鲜水果、植物的根、叶和绿茎中果胶含量特别丰富，由于含有亲水基团，果胶与水有强大的结合力，是有力的凝胶化剂，广泛应用于食品、制药和化妆品等行业[3]。要从植物中分离出天然果胶难度大，因此，传统的果胶定量测定都采用间接方法，以测定果胶水解后生成的各种产物的含量为基础，然后转换为果胶含量，主要有重量法、容量法、比色法[4-6]。近年来，又陆续出现了高效液相色谱法（HPLC）[7]、气相色谱法（GC）[8]、流动分析法[9]等。其中重量法操作繁冗、不稳定、回收率低，容量法测定时，若样品中有颜色则不容易确定滴定终点，应用范围也受到限制，而HPLC、GC和流动分析法都要求用特定的检测仪器，并且运行成本较高。目前，已有关于比色法对果胶含量进行测定的研究报道[10-11]，但没有针对水果及其制品中果胶的测定方法标准。我们按照国家有关测定方法标准的要求，对测定和显色条件进行了试验，以期为制定水果及其制品中果胶物质的测定方法标准提供科学依据。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　标准物质：半乳糖醛酸（分析纯）。
　　试验样品：香蕉；猕猴桃；桃；甜樱桃；橙汁；葡萄汁。
　　试剂：无水乙醇（优级纯）；氢氧化钠（分析纯）；硫酸（优级纯，与咔唑-无水乙醇溶液不应产生颜色反应）；咔唑（分析纯）。
　　仪器：水浴振荡器；离心机；分光光度计。
　　1.2 方法
　　1.2.1 方法原理 用无水乙醇沉淀试样中的果胶，在碱性条件下，经水解后生成半乳糖醛酸，后者在硫酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色络合物，该络合物在525 nm处有最大吸收，其吸收值与果胶含量成正比，以半乳糖醛酸为标准物质，标准曲线法定量。
　　1.2.2 样品预处理 称取1.0 g~5.0 g（精确至0.001 g）试样于50 mL刻度离心管中，加入少量滤纸屑，再加入35 mL约75 ℃的无水乙醇，在85 ℃水浴振荡器中加热10 min，充分振荡。冷却，再加无水乙醇使总体积接近50 mL，在4 000 r・min-1的条件下离心15 min，弃去上清液。在85 ℃水浴中用67%乙醇溶液洗涤沉淀，离心分离，弃去上清液，此步骤反复操作，直至上清液中不再产生糖的穆立虚反应为止，保留果胶沉淀A。同时做试剂空白试验。
　　1.2.3 果胶提取液的制备 将果胶沉淀A用去离子水全部洗入100 mL容量瓶中。加入1.0 mol・L-1氢氧化钠溶液5.0 mL，用水稀释至刻度，混匀。至少放置15 min，并不时摇荡。过滤，保留滤液B，用于比色测定。
　　1.2.4 标准系列配制 以1 000 mg・L-1的半乳糖醛酸溶液为标准储备溶液，制备系列质量浓度为0.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 mg・L-1的标准使用溶液。
　　1.2.5 测定 移取1.0 mL滤液B于25 mL玻璃试管中。另分别移取1.0 mL各个浓度的半乳糖醛酸标准系列溶液于玻璃试管中。于试样及标准溶液中各加入0.25 mL 0.1%咔唑-无水乙醇溶液，产生白色絮状沉淀，不断摇动试管，再快速加入5.0 mL硫酸。立刻将试管放入85 ℃水浴振荡器内加热20 min，取出后放入自来水浴中使之迅速冷却，在1.5 h时间内用分光光度计在525 nm波长处测量其吸光度，绘制标准曲线比较定量（按上述方法同时做空白试验，用空白调0）。

　　1.2.6 结果计算 样品中果胶含量以半乳糖醛酸质量分数ω计，单位为g・kg-1，按公式（1）进行计算：
　　 ω=（1）
　　式中： ρ―滤液B中半乳糖醛酸质量浓度，单位为mg・L-1；V―果胶沉淀A定容体积，单位为mL；m―试样质量，单位为g。
　　1.3 显色条件试验
　　设吸收波长（360~700 nm）、0.1%咔唑-无水乙醇溶液用量（0.0~1.0 mL）、硫酸用量（1.0~9.0 mL）、显色温度（40~100 ℃）、显色时加热时间（0~40 min）、冷却方式（室温自然冷却、自来水浴快速冷却）、显色后稳定时间（0~105 min）等为显色条件试验。
　　1.4 准确度与精密度试验
　　以香蕉、猕猴桃、桃、甜樱桃、橙汁、葡萄汁等为试材，对方法的准确度与精密度进行研究。
　　2 结果与分析
　　2.1 显色条件的选择
　　2.1.1 最佳吸收波长的确定 吸收波长在比色定量方法中是最关键的。按试验方法，在显色温度85 ℃，加热时间20 min，硫酸加入量5.0 mL，0.1%咔唑无水乙醇溶液用量0.25 mL条件下，在360~700 nm波长内，对果胶水解产物半乳糖醛酸在硫酸溶液中与咔唑试剂发生缩合反应后，生成的紫红色络合物进行吸收波长扫描，结果见图1。可以看出，50 mg・L-1和90 mg・L-1的半乳糖醛酸溶液表现出一致的规律，即与咔唑试剂发生缩合反应后，生成的紫红色络合物在394 nm附近和525 nm附近处各有1个吸收峰，在525 nm附近吸光度最大。因此本方法选择λmax=525 nm作为合适的工作波长。
　　2.1.2 咔唑无水乙醇溶液用量的确定 咔唑无水乙醇溶液为显色剂，其加入量严重影响显色效果。按试验方法，在显色温度85 ℃，加热时间20 min，硫酸加入量5.0 mL条件下，改变0.1%咔唑-无水乙醇溶液用量，测其吸光度A，重复3次，结果见图2。可以看出，无论是70 mg・L-1还是100 mg・L-1的半乳糖醛酸溶液，在咔唑-无水乙醇溶液用量为0.20~0.35 mL时吸光度较大，用量为0.25 mL时吸光度最大。故选择咔唑-无水乙醇溶液最佳用量为0.25 mL。
　　2.1.3 硫酸用量的确定 半乳糖醛酸在硫酸中与咔唑试剂发生缩合反应，因此硫酸的加入量直接影响到缩合反应的快慢，严重影响显色效果。在显色温度85 ℃，加热时间20 min，0.1%咔唑无水乙醇溶液用量0.25 mL条件下，分别对加硫酸量为1.0~9.0 mL的半乳糖醛酸溶液进行显色，重复3次，结果见图3。可以看出，无论是70 mg・L-1还是100 mg・L-1的半乳糖醛酸溶液，硫酸加入量为4.0~6.0 mL时吸光度都较大，且5.0 mL时吸光度最大，故选择5.0 mL为硫酸最佳加入量。
　　2.1.4 显色温度的确定 试验在硫酸加入量5.0 mL，0.1%咔唑-无水乙醇溶液用量0.25 mL，加热时间20 min条件下，分别对温度为25~100 ℃时的半乳糖醛酸溶液进行显色，重复3次，结果见图4。可以看出，无论是70 mg・L-1还是100 mg・L-1的半乳糖醛酸溶液，温度75~95 ℃间吸光度都较大，且85 ℃时最大，故选择85 ℃为最佳显色温度。这对张小玲等[12]在室温下进行显色的传统方式进行了改进。
　　2.1.5 显色时加热时间的确定 在硫酸加入量5.0 mL，0.1%咔唑-无水乙醇溶液用量0.25 mL，显色温度85 ℃条件下，设加热时间0、5、10、15、20、25、30、40 min 8个处理，重复3次，显色后测定其吸光度，结果见图5。可以看出，70 mg・L-1和100 mg・L-1的半乳糖醛酸溶液表现出一致的规律，即不加热的处理吸光度最低，加热5 min起吸光度迅速升高，20 min达到最高，超过20 min后吸光度略有下降，可能是加热时间过长时破坏了半乳糖醛酸的结果，故选择20 min为最佳显色时间。本方法与张小玲等[12]在室温下进行显色需要稳定1.5 h相比，大大缩短了显色时间，提高了工作效率。
　　2.1.6 冷却方式和显色后稳定时间的确定 由于显色条件是85 ℃水浴，如果采取室温下自然冷却，冷却时间就会较长，冷却过程中显色溶液的稳定性就值得考虑。对不同浓度的半乳糖醛酸溶液显色后在室温条件下自然冷却过程中525 nm波长处吸光度的变化进行了观察，重复3次，试验结果见图6。可以看出，30 mg・L-1和50 mg・L-1的半乳糖醛酸溶液经过显色后，在自然冷却条件下，吸光度都随冷却时间的延长而逐渐降低。以冷却15 min时为起点，在冷却30 min时吸光度降低了1.5%~1.7%，在冷却45 ~105 min时吸光度降低了2.6%~9.5%。因此在室温自然冷却条件下，半乳糖醛酸在硫酸中与咔唑试剂发生缩合反应后生成的紫红色络合物不稳定，无法确定最佳的测定时间，说明室温自然冷却条件不可行。
　　鉴于室温自然冷却条件不可行，进行了自来水浴快速冷却试验，即水浴加热后立即将盛有显色溶液的玻璃试管放入自来水中进行冷却。本试验对显色后105 min内分别对70 mg・L-1和100 mg・L-1的半乳糖醛酸溶液在525 nm波长下的吸光度进行了测定，结果见图7。可以看出，在自来水浴快速冷却条件下，无论是低浓度还是高浓度的半乳糖醛酸溶液，显色后105 min内显色溶液吸光度相对稳定，低浓度溶液降低了0.9%，高浓度溶液降低了0.3%，都不超过1.0%。说明自来水浴快速冷却方式可行，并在半乳糖醛酸溶液显色后1.5 h内进行比色测定即可（但必须在水浴加热后立即放入自来水中进行冷却，否则吸光度将逐渐降低）。该方法延长了体系稳定时间，克服了文献[4]中所用方法显色后在自然冷却条件下必须在20 min内测定的局限性。
　　2.2 样品分析
　　2.2.1 线性范围 水果及其制品中果胶含量较高的样品，对处理后待测液必须稀释到线性范围内才能进行测定。在0~120 mg・L-1内，525 nm波长条件下，半乳糖醛酸与咔唑试剂发生缩合反应后生成的紫红色络合物吸收值与半乳糖醛酸浓度具有良好的线性关系（图8），回归方程为y=0.014 2x-0.007 5，R2=0.999 4，为稳妥起见，本方法将标准曲线的线性范围定为0~100 mg・L-1。
　　2.2.2 准确度 以香蕉、猕猴桃和桃为试验样品，对方法的准确度进行了试验，回收率试验测定结果见表1。可以看出，以半乳糖醛酸为添加物质，不同添加水平下，香蕉、猕猴桃、桃3个样品的添加回收率都较高，均能达到一般理化品质测定的要求，其中香蕉的回收率为86.7%~95.6%，猕猴桃的回收率为92.0%~98.6%，桃的回收率为87.6%~96.5%，测定结果符合测定方法标准的基本要求[13]，表明本方法准确度良好，符合测定要求。
　　2.2.3 精密度 由同一操作者用相同的前处理和设备，在短时间内对香蕉、猕猴桃、桃、甜樱桃、橙汁、葡萄汁等不同样品中的果胶含量进行了重复测定，检测结果见表2。葡萄汁样品变异系数最高（4.38%），其余样品变异系数均低于4.0%，说明本方法精密度高，符合测定方法标准的基本要求[13]。
　　3 讨 论
　　当果胶沉淀物从样品提取液里被离心分离时，往往有一些不溶性固体微粒悬浮在上清液中，随着上清液的弃去而流失，就有可能造成测定结果偏低或回收率低，为了避免这种现象，可在第1次提取时加入少量滤纸屑。同时，针对果胶含量较低的样品如葡萄汁等，可通过适当增加称样量或减小定容体积的方式来提高测定的灵敏度和准确度。

　　试验发现当浓硫酸中NO3-、Fe3+、Cu2+含量达到一定范围时，对测定有干扰。C（Fe3+）＞0.000 1%或C（NO3-）＞0.000 1%时，加入咔唑-无水乙醇溶液后待测液出现深绿色，C（Cu2+）＞0.000 01%时，加入咔唑-无水乙醇溶液后待测液出现深蓝色，这些颜色都会干扰或掩盖半乳糖醛酸与咔唑试剂发生缩合反应生成的络合物所呈现的紫红色，此时应考虑硫酸的纯度。本方法建议采用正规厂家生产的优级纯硫酸，在测定前应做硫酸与咔唑溶液反应试验，不产生颜色反应时方可使用。
　　试验表明，加硫酸所用的时间很关键，如果在6 s内快速加入5.0 mL硫酸，溶液的温度能达到约85 ℃，这就能使显色溶液和水浴的温度都保持在85 ℃左右，可以达到最佳的显色效果。因此建议借助加液枪或瓶口分配器等来快速加入硫酸。
　　4 结 论
　　根据试验结果，认为硫酸-咔唑比色法测定水果及其制品中果胶含量的最佳显色条件为：在1.0 mL滤液中，加入0.25 mL 0.1%咔唑-无水乙醇溶液，迅速加入5.0 mL硫酸，于85 ℃水浴20 min后在自来水浴中冷却，1.5 h内在525 nm波长条件下测定。该条件下标准曲线线性范围广、相关性好，精密度和准确度符合相关标准要求。
　　参考文献 References:
　　[1] TONG Zhao-guo， WANG Fei， GAO Zhi-hong， ZHOU Jun， XU Qiu-hong， ZHANG Zhen. Advances in research on the relationship between pectolytic enzymes and fruit softening[J]. Journal of Fruit Science， 2011， 28（2）: 305-312.
　　佟兆国，王飞，高志红，周军，徐秋红，章镇. 果胶降解相关酶与果实成熟软化[J]. 果树学报，2011，28（2）: 305-312.
　　[2] GUAN Jun-feng， MA Zhi-hong. Apple fruit softening in relation to pectin content permeability of cell membrane and calcium form[J]. Journal of Fruit Science， 2001，18（1）: 11-14.
　　关军锋，马智宏. 苹果果实软化与果胶含量、质膜透性和钙溶性的关系[J]. 果树学报， 2001，18（1）:11-14.
　　[3] HUANG Wei-kun. Food inspection and analysis[M]. Beijing: China Light Iindustry Press， 1989: 45-48.
　　黄伟坤. 食品检验与分析[M]. 北京: 中国轻工业出版社，1989:45-48.
　　[4] LI Chun-ming，GUAN Chun-mei. Determination of Carbazole in maize pectin content of the seed coat[J]. Chinese Journal of Public Health， 2004， 20（4）: 490.
　　李春明，管春梅. 咔唑比色法测定玉米种皮中的果胶含量[J]. 中国公共卫生，2004，20（4）: 490.
　　[5] ZHANG Xiao-ling. Pectin carbazole sulfuric acid spectrophotometric method[J]. Journal of Gansu Agricultural， 1999， 34（1）: 75-78.
　　张小玲. 果胶的咔唑硫酸分光光度测定法研究[J]. 甘肃农业大学学报，1999，34（1）: 75-78.
　　[6] HUANG Tian-bin. Extraction and determination of pectin[J]. Journal of Wenshan University， 2004， 17（4）: 380-381.
　　黄天斌.果胶的提取方法与测定[J]. 文山师范高等专科学校学报，2004，17（4）: 380-381.
　　[7] WU Yu-ping， YANG Guang-yu， WANG Dong-dan. Determination of pectin in tobacco with high performance liquid chromatography[J]. Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory， 2004（1）: 183-185.
　　吴玉萍，杨光宇，王东丹. 高效液相色谱法测定烟草中的果胶含量[J]. 光谱实验室，2004（1）: 183-185.
　　[8] LI Bo， XU Shi-ying. Determination of uronic acids in polysaccharides with Gas Liquid Chromatography[J]. Chinese Journal of Chromatography， 2004， 22（5）: 560.
　　李波，许时婴. 气液相色谱法测定多糖中的糖醛酸[J]. 色谱，2004， 22（5）: 560.
　　[9] XU Zhi-qiang， CHEN kai-bo， CAI Bing. Determination of pectin in tobacco with enzymolysis-autoanalyzer[J]. Tobacco Science & Technology， 2005（9）: 26-28.
　　徐志强，陈开波，蔡兵. 酶解-流动分析法测定烟草中的果胶含量[J]. 烟草科技，2005（9）: 26-28.
　　[10] XU Wen， WANG Guang-hui， WANG Cun-wen， CHEN Ya-qin. Determination of premna microphylla pectin content by carbazole spectrophotometric method[J]. Food and Machinery， 2006， 22（3）: 133-135.
　　徐汶，王光辉，王存文，陈亚琴. 咔唑比色法测定豆腐柴叶果胶含量的研究[J]. 食品与机械，2006，22（3）: 133-135.
　　[11] MA Dong-ping， LIU Wei-juan， WEI Qing， LIU Gang， YANG Yan-shu. Determination of pectin in tobacco with 3，5-Dinitrosalicylic acid colorimetry[J]. Tobacco Science & Technology， 2006（8）: 38-41.
　　马东萍，刘维涓，卫青，刘刚，杨廷书. 3，5-二硝基水杨酸显色法测定烟草中的果胶[J]. 烟草科技，2006（8）: 38-41.
　　[12] ZHANG Xiao-ling. Pectin carbazole sulfuric acid spectrophotometric method[J]. Journal of Gansu Agricultural，1999，34（1）: 75-78.
　　张小玲. 果胶的咔唑硫酸分光光度测定法研究[J]. 甘肃农业大学学报，1999，34（1）: 75-78.
　　[13] General Administration of Quality Supervision， Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China（AQSIQ）， Standardization Administration of China. Accuracy （trueness and precision） of measurent methods and results-Part 4: Basic methods for the trueness of a standard measurement method[S]. Beijing: China Standard Press， 2006: 5.
　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第4部分：确定标准测量方法正确度的基本方法[S]. 北京: 中国标准出版社，2006: 5.

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