线粒体DNA的结构特征及在鹿科动物物种鉴定中的应用

来源:用户上传      作者: 徐佳萍

　　摘要 最新研究表明，作为生物能量的生成场所线粒体是一种具有自我遗传控制功能，本文重点针对鹿科动物的线粒体DNA结构特征进行了研究和分析，通过具体的实验验证了鹿科动物物种鉴定中线粒体DNA的实际功能和应用。同时，还对线粒体DNA的提取方法进行了探索，最后就线粒体DNA的序列以及动物物种进行了鉴定，就鹿科动物线粒体DNA的研究成果提出了意见。
　　关键词 染色体；线粒体DNA；鹿科动物；物种鉴定
　　中图分类号Q959 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2012）58-0082-02
　　0 引言
　　线粒体是1898年被命名的，其实线粒体的发现却要追踪到1850年。线粒体外膜比较平滑，具有两层的膜包被，向内的折叠内膜形成嵴，两层膜中间有一个腔，基质居于线粒体的中央。基质内部有可以喝三羧酸进行循环时所需要的所有酶类，内膜上有ATP酶复合体和呼吸链酶系。线粒体其实就是细胞内形成ATP和氧化磷酸化的关键场所，因此，被形象地成为细胞的动力加工厂。
　　1 线粒体DNA结构特征
　　真核生物所呼吸所用的细胞器就是线粒体，不同物种的细胞之间，其线粒体的数目有着很大的差距，通常情况下都在100个~3 000个之间，植物细胞中一般都会含有50个~100个左右的线粒体，而动物的细胞中其线粒体的数目差异性要远远高于植物体内的线粒体数目，多的要达到1 000个，少的却只有50个左右。实验表明，植物细胞中的所有线粒体都会参与植物本身的一系列新陈代谢的全过程。植物体内的所有的线粒体通过自身的功能可以把细胞所吸收和合成的糖类、脂肪等所有的储藏能量经过进一步地氧化而生成了CO2和H2O，最后通过特定的方式将其释放出去，同时它还能将所存储的一些太阳能经过一系列的转换生成了细胞用以维持自身的生理功能的具体能量-ATP分子。正是由于植物细胞中的线粒体少于动物体内的线粒体，从而制约了能量的来源，因此植物就不可能出现和动物一样的自由活动和快速增长。由于线粒体DNA（mtDNA）相对比较小，所以它仅能决定本身最基本的一些特征，缺少多余的编码结构，因此就难以产生有效的修复功能。实验表明，只要线粒体DNA受到了不同程度的损伤，哪怕只是一个极其微小的变化，都会直接导致和引发线粒体的正常的功能，这种效应还具有一定的累加性，变异的幅度会随着损害程度的变化而不断地加大，最后就会产生连细胞核都无法具备的一些独特功能。
　　2 线粒体DNA的提取方法
　　鹿科动物的线粒体DNA的常见的提取方法有：碱变性法；柱层析法；氯化铯密度梯度离心法；DNase法柱层析法；改良碱变性法等几种。
　　碱裂解法是借鉴质粒快速提取法所建立，在差速离心获得线粒体后。通过高盐溶液复性、碱变性，从而分离线状的nDNA和环状的mtDNA，从而获得了mtDNA；层析分离技术属于物理的分离的方法，它是利用混合物中的每一组分物理化学性质的差别，所有的组分以不同程度进行分布在两相中，从而使所有的组分以不同速度移动而达到分离；密度梯度离心法就是将样品的粒子在密度梯度的介质中进行离心，其介质是由小分子和溶剂所组成组成，离心的过程中，离轴心越远介质的密度就会越大；DNase法是在差速离心获得线粒体后，利用具体浓度的DNase进行消化，可以有效地去除附着在线粒体表面的核DNA；改良的碱变性法是在差速离心获得线粒体后，利用DNase消化附着在线粒体表面的nDNA，再通过碱变性，高盐溶液复性，获得纯净的mtDNA。
　　3 线粒体DNA 的序列分析
　　3.1 材料
　　新鲜鹿肝、Puc18载体、肾组织、大肠杆菌DH5a感受态细胞、MegaBACE1000测序仪。
　　3.2 方法
　　3.2.1 提取线粒体DNA
　　取新鲜或-80℃保存的鹿肝、肾组织，低温下打碎、匀浆1 000r/min离心10min，上清重复离心2次~3次，上清15 000r/min离心10min以沉淀线粒体，重悬线粒体沉淀，RNase处理去除RNA碱裂解抽提线粒体DNA酚：氯仿抽提去除残余的蛋白质，加入1/10体积3mol/L 醋酸钠及2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤，干燥，溶于TE缓冲液。
　　3.2.2 建立线粒体DNA文库
　　定量DNA后，超声波打碎，补齐末端，电泳割胶回收3kb左右片段，连接载体puc18，电转化宿主菌DH5a，短时复苏后铺板，蓝白斑筛选，挑取单克隆，96深孔板培养24h。
　　3.2.3 利用鸟枪法进行测序
　　随机挑选7板（7X96个）培养的单克隆，碱裂解提取质粒模板，电泳检测提取的模板长度和含量，挑取其中含量在100ng/μL、含3kb插入片段的3 板（3X96个）模板，利用puc18多克隆位点两侧的M13通用引物进行双向测序反应，MegaBACE1000测序，测序结果以文件形式输入曙光大型计算机。
　　4 鹿科动物物种鉴定
　　因mtDNA具有结构简单、分子量小、进化速度快和母性单性遗传等特点，通常都是利用mtDNA序列进行鹿产品的检测。先后采用tRNAGlu/Cyt b、16S rRNA/tRNAVal序列，Cyt b基因序列，12S rRNA基因和D-loop区序列及12S rRNA基因序列，运用PCR-RFLP技术成功地鉴定了各种食品中的有禽类、蹄类和水产类，鉴定的灵敏度高。用三种限制性酶EcoRⅠ、BamHⅠ和ScaⅠ对梅花鹿和马鹿的肉进行了区分，并取得了成功。通过PCR扩增成功地扩增出了鹿特异性PCR产物，而其它常见伪充药材源性动物没有扩增出PCR产物或扩增片段的数量和长度不同，从而准确、快捷地鉴定出了鹿类中药材。使用PCR方法扩增赤鹿和狍毛发样品DNA提取物的一段D-loop区序列，因扩增产物的长度有差异，所以成功地区别了这两种动物的毛发。
　　5 结论
　　与GenBank中已登录的70种哺乳动物线粒体基因组全序列的比较研究表明：鹿科动物线粒体基因组序列较稳定，结构趋于一致，全长范围在16kb~17.5kb之间，大多在16.5kb左右，是理想的遗传标记之一。因此，利用线粒体DNA序列来鉴定鹿科动物物种是一种非常有效的物种鉴别方法，可以保护消费者的合法权益，促进畜牧业的健康稳定发展。
　　参考文献
　　[1]王文，施立明.一种改进的动物线粒体DNA提取方法[J].动物学研究，2003，14(2)：197-198.
　　[2]Koichito Tamura&Tadashi Aotsuka.Rapid Isolation Method of Animal.

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