外源生长激素对水稻T-DNA插入突变体褐飞虱抗性的影响及其农艺性状测定

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　　摘要：【目的】分析外源生長激素对水稻T-DNA插入突变体褐飞虱抗性的影响，并测定其农艺性状，为突变基因介导的抗虫分子机理研究提供理论参考。【方法】以水稻受体中花11（ZH11）及其T-DNA插入突变体CF54为材料，利用三引物PCR鉴定出纯合突变株系，并用乙烯利（ET）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）对ZH11及其纯合突变株系进行处理，测定植株上褐飞虱的蜜露分泌量和虫体增重量。对ZH11及其纯合突变株系的株高、穗长、有效穗数、有效分蘖数、每穗实粒数和千粒重等农艺性状进行测定。【结果】从突变体CF54后代中共筛选出10个株系，其中纯合突变株系有2个，分别为CF54-6和CF54-10。经ET、SA和MeJA处理后ZH11及其纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的虫体增重量和蜜露分泌量较未处理对照显著（P<0.05，下同）或极显著（P<0.01，下同）下降，但未处理对照间均无显著差异（P>0.05，下同）。经MeJA处理后，纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的虫体增重量和蜜露分泌量较ZH11显著下降，但经SA和ET处理的纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的蜜露分泌量和虫体增重量与ZH11无显著差异。纯合突变株系CF54-6和CF54-10的有效分蘖数、有效穗数和千粒重与ZH11无显著差异，但株高、穗长和每穗实粒数显著或极显著高于ZH11。【结论】ET、SA和MeJA 3种外源生长激素均能诱导水稻野生型及其纯合突变株系植株对褐飞虱的取食与生长发育产生抑制作用，尤其是MeJA抑制效果最佳，推测纯合突变株系抗虫性受茉莉酸（JA）信号途径的影响更大。T-DNA插入明显影响水稻植株的农艺性状。
　　关键词： 水稻;T-DNA插入突变体;褐飞虱;抗性;茉莉酸甲酯（MeJA）;乙烯利（ET）;水杨酸（SA）;农艺性状
　　中图分类号： S511.035.3                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0230-07
　　Abstract：【Objective】The purpose was to identify the effect of growth hormone treatment on brown planthopper （BPH） resistance of rice T-DNA insertion mutants， and to detect the agronomic traits of the mutants，which could provide theoretical reference for the study of molecular mechanism of insect resistance mediated by mutant gene. 【Method】 Rice variety Zhonghua 11（ZH11） and its T-DNA insertion mutant CF54 were used as materials. Homozygous insertion mutants were identified by the tri-primers PCR method. ZH11 and its homozygous mutant were treated with ethephon（ET），salicylic acid（SA） and methyl jasmonate（MeJA）to measure the BPH honeydew secretion and the weight gain. Finally，agronomic traits，such as the plant height，spike length，effective spikes，number of productive panicles，grain number per spike and 1000-grain weight of ZH11 and the mutants were measured. 【Result】Ten lines were screened out from the offspring of mutant CF54，including two homozygous mutant lines CF54-6 and CF54-10. After ET，SA or MeJA treatments，the body weight gain and honeydew secretion of ZH11 and its homozygous mutant strains CF54-6 and CF54-10 on plants were significantly（P<0.05，the same below） or extremely（P<0.01，the same below） lower than those of untreated control，but no significant difference was detected between untreated controls（P>0.05， the same below）. After treated with MeJA，the homozygous mutant lines CF54-6 and CF54-10 displayed significant reduction in BPH honeydew secretion and the weight gain comparing with ZH11. However，there was no significant difference in honeydew secretion and body weight gain between homozygous mutants CF54-6 and CF54-10 treated with SA and ET and ZH11. The productive panicles，effective spikes and 1000-grain weight of homozygous mutant lines CF54-6 and CF54-10 treated by SA and ET were not significantly different from those of ZH11. But the plant height，spike length，and grain number per spike increased significantly or extremely higher than  ZH11. 【Conclusion】The three exogenous growth hormones ET，SA and MeJA can induce the inhibition of feeding and growth of BPH in wild type rice and homozygous mutant rice plants，the effects of MeJA is the optimal. It is speculated that the resistance of these two mutant lines are more affected by jasmonic acid（JA） signaling pathway. T-DNA insertion affects the agronomic traits of rice plants. 　　Key words： rice; T-DNA insertion mutant; Nilaparvata lugens; resistance; methyl jasmonate（MeJA）; ethephon （ET）; salicylic acid（SA）; agronomic trait
　　0 引言
　　【研究意义】水稻（Oryza sativa L.）是我国的第一大粮食作物，而褐飞虱（Nilaparvata lugens）是造成水稻受害减产的最主要害虫之一（王慧等，2016）。实践表明，抗虫水稻品种的选育是防治褐飞虱最高效、无污染的方法，构建水稻突变体库为水稻功能基因组研究及其品种选育提供了重要资源（Meng et al.，2017）。因此，考察水稻相关突变体对褐飞虱的抗性，并对其农艺性状进行测定，可为抗褐飞虱新基因的发掘及新品种选育提供参考依据。【前人研究进展】目前，从水稻中发现并被定位的抗褐飞虱基因有35个（Wang et al.，2018），成功克隆的抗性主效基因有8个，如Bph3、Bph6、Bph9、Bphl4和Bph26等（Du et al.，2009;Liu et al.，2014;Srinivasan et al.，2015;Zhao et al.，2016;Guo et al.，2018），其可有效提高水稻对褐飞虱的抗性。但利用这些抗性基因通过分子标记育种等手段培育抗褐飞虱水稻的周期相对较长，且大多数抗性品种只含有单个或少数抗褐飞虱基因，可能较难应对褐飞虱生物型变异的发生，导致水稻品种对褐飞虱的抗性逐渐下降（王海鹏等，2016）。随着反向遗传学技术的发展，利用其鉴定抗性相关基因可加快对抗虫相关基因功能及其分子机理研究，从而促进水稻抗虫育种。姚张良等（2014）构建了水稻OsRCI-1基因的RNAi表达载体并获得突变株系ir-rci，通过对褐飞虱生物量（初羽化体重）、发育历期、羽化数、单雌卵量和长翅型比率等多个生长发育指标的测定，结果表明，OsRCI-1基因功能沉默后水稻对褐飞虱的抗性显著增强。郭惠民（2015）以水稻T-DNA插入突变体为研究对象，通过田间观察从11000多份纯合突变体中获得259份抗褐飞虱的突变体，并通过室内抗虫实验筛选出1个高抗褐飞虱的突变体T35。此外，有研究发现外源生长激素处理对褐飞虱与水稻间的互作起着重要作用。吴莹莹等（2012）研究发现，用0.25和0.50 mmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）处理水稻品种IR26、IR36和TN1后，水稻植株对褐飞虱II生物型的抗性显著提高，由感虫水平上升至抗虫水平。Guo等（2018）使用外源水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）处理感褐飞虱水稻和携带Bph6基因的抗褐飞虱水稻，结果发现，褐飞虱的存活率明显降低，水稻植株对褐飞虱的抗性增强。【本研究切入点】目前鲜见以蜜露分泌量和虫体增重量为抗虫指标探讨不同外源生长激素处理对水稻突变体抗褐飞虱性影响的相关研究报道。【拟解决的关键问题】以水稻T-DNA插入突变体为材料，利用乙烯利（ET）、SA和MeJA对其进行处理，以蜜露分泌量和虫体增重量为抗虫指标鉴定突变体植株对褐飞虱的抗性水平，分析突变体中突变基因介导的抗性所参与的信号通路，为该基因介导的抗虫分子机理研究提供理论参考。
　　1 材料与方法
　　1. 1 试验材料
　　供试的水稻受体中花11（ZH11）及其T-DNA插入突变体CF54来源于华中农业大学突变体库;褐飞虱虫源来源于广西大学农场实验田并在感虫品种台中本地1号（TN1）上饲养并繁殖;SA购自索莱宝（北京）科技有限公司;MeJA购自麦克林（上海）生化科技有限公司;ET购自美国Sigma-Aldrich公司。
　　1. 2 纯合突变体的鉴定
　　参照张斌和何福林（2017）的三引物PCR从水稻T-DNA插入突变体CF54中鉴定获得纯合突变株系。依据T-DNA插入位点，FP为插入位点上游基因序列上的正向引物，RP为插入位点下游基因序列上的反向引物，NP为T-DNA左端侧翼序列上的中间引物（表1）。PCR反应体系10.0 μL：2×Taq Master Mix 5.0 μL，正、反向引物（FP和RP）各0.2 μL，NP中间引物（载体上引物）0.4 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O补足至10.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，进行32个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
　　1. 3 生长激素处理
　　SA、MeJA和ET供试浓度分别为0.5、1.0和0.5 mmol/L（鲁玉杰等，2006;吴莹莹等，2012）。其中SA和MeJA以50 mmol/L Na2HPO4缓冲液（用1 mol/L盐酸滴定至pH 8.0）为溶剂;ET以蒸馏水（pH 7.2）为溶剂。
　　参照鲁玉杰等（2006）的方法：取苗龄30 d的盆栽（直径25 cm，高度15 cm）水稻苗（4株/盆）共45盆180株，处理前1 d洗净植株茎秆，然后分别用SA、MeJA和ET喷洒植株，分别以50 mmol/L Na2HPO4缓冲液和蒸馏水为对照，按5 mL/株的剂量处理。将处理后的水稻植株置于环境条件为温度（28±2）℃、光照/黑暗为12 h/12 h、相对湿度70%～80%的温室内培养24 h，然后进行接虫处理试验。
　　1. 4 蜜露量和虫体增重量测定
　　水稻植株经生长激素处理24 h后，將Parafilm蜡膜制作的蜡袋（30 mm×35 mm）固定在水稻茎秆中间部位（图1），内接1头将在24 h内羽化的褐飞虱雌成虫，48 h后终止褐飞虱取食，取下蜡袋。按照每株接种2个蜡袋，每盆接8个蜡袋，每盆苗中取1株苗固定2个未接虫的蜡袋作对照，每处理设3盆，即以上试验均3个重复。使用十万分之一精度天平分别称量褐飞虱取食前后的蜡袋重量和虫体重量（邓钊等，2016）。蜜露分泌量为褐飞虱取食前后蜡袋的重量差，虫体增重量为褐飞虱取食前后虫体重量差。以虫体增重量和蜜露分泌量的平均值来综合评定水稻植株对褐飞虱的抗性水平。 　　1. 5 农艺性状测定
　　2017年秋季将ZH11及筛选获得的纯合突变体株系种植于广西大学试验田，并在成熟期对其进行农艺性状测定，包括株高、穗长、有效穗数、有效分蘖数、每穗实粒数和千粒重。每个株系在田间种植10行，每行10株，设3个重复。每个重复两端的株行和每行两端的单株均不统计农艺性状。采用Excel 2007和SPSS 18.0进行数据统计分析及制图。
　　2 结果与分析
　　2. 1 纯合突变株系的鉴定结果
　　根据三引物PCR筛选纯合突变体株系。具体过程：FP与RP引物间因T-DNA插入导致该组合无法扩增出目标条带，仅FP与NP组合能扩增出大小为508 bp的单一条带;而未插入T-DNA的阴性植株中，FP与RP组合可扩增出大小为914 bp的单一条带;杂合插入突变体中，一条染色体上有T-DNA插入，FP与NP组合可扩增出大小为508 bp的条带，而另一条染色体无T-DNA插入，FP也可与RP组合扩增出大小为914 bp的条带。利用该方法从突变体CF54后代中共筛选出10个株系，其中纯合突变株系2个，分别为CF54-6和CF54-10，杂合突变株系有5个，无突变的株系有2个，另外一个株系无法判断（图2）。
　　基于突变体库中提供的信息，利用突变体CF54的侧翼序列（962 bp）在NCBI中进行BLAST比对，结果发现，T-DNA的插入位点在水稻第7染色体上，位于Os07g44710基因下游9.94 kb和Os07g44730基因上游2.02 kb的基因间隔区域，并未插入有注释功能的基因内部（图3）。其中，Os07g44710基因的注释功能为钙调素依赖性蛋白激酶，而Os07g44730基因的注释功能为未知蛋白。由于突变体CF54中T-DNA插入在基因间隔区域，无法从插入位点的信息推测是否由于突变而导致性状改变。
　　2. 2 MeJA处理对褐飞虱蜜露分泌量和虫体增重的影响
　　经MeJA处理的ZH11及其纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的蜜露分泌量和虫体增重均存在显著差异（P<0.05，下同），较未处理对照均显著或极显著（P<0.01，下同）降低，未处理对照间无显著差异（P>0.05，下同）（图4）。其中，经MeJA处理的纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱蜜露分泌量分别为2.06和2.22 mg，较对应的对照极显著降低52.5%和51.2%，比MeJA处理的ZH11显著降低35.4%和30.4%（图4-A）。经MeJA处理的纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱虫体增重量分别为0.31和0.33 mg，较对应的对照极显著降低61.3%和60.7%，比MeJA处理的ZH11显著降低44.6%和41.1%（图4-B）。综上所述，在MeJA诱导作用下，ZH11及其纯合突变株系植株上褐飞虱的取食受到抑制，生长发育延缓，尤其对纯合突变株系植株上褐飞虱的生长发育影响更明显。
　　2. 3 SA处理对褐飞虱蜜露分泌量和虫体增重的影响
　　经SA处理的ZH11与其纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的蜜露分泌量和虫体增重量均无显著差异，但较未处理对照均显著降低，未处理对照间也无显著差异（图5）。其中，经SA处理的ZH11及其纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的蜜露分泌量分别为3.15、2.93和3.02 mg，较对应的对照显著降低31.5%、32.5%和33.6%（图5-A）。经SA处理的ZH11及其纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的虫体增重量分别为0.55、0.51和0.49 mg，较对应的对照显著降低34.5%、36.3%和41.0%（图5-B）。综上所述，在SA诱导作用下，ZH11及其纯合突变株系植株上褐飞虱的取食均受到抑制，生長发育延缓。
　　2. 4 ET处理对褐飞虱蜜露分泌量和虫体增重的影响
　　经ET处理的ZH11及其纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的蜜露分泌量和虫体增重量变化情况与SA处理相似（图6）。其中，经ET处理的ZH11及其纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的蜜露分泌量分别为3.08、3.25和3.19 mg，较对应对照显著降低34.9%、31.9%和31.7%（图6-A）。经ET处理的ZH11及其纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的虫体增重量分别为0.57、0.53和0.58 mg，较对应的对照显著降低36.0%、36.1%和31.8%（图6-B）。综上所述，在ET诱导作用下，ZH11及其纯合突变株系植株上褐飞虱的取食受到抑制，生长发育延缓。
　　2. 5 农艺性状测定结果
　　对筛选出的纯合突变株系CF54-6和CF54-10农艺性状进行测定，结果如表3所示。2个纯合突变株系的有效分蘖数、有效穗数和千粒重与ZH11无显著差异，其中，CF54-6和CF54-10的有效穗数均高于ZH11，但有效分蘖数千粒重均低于ZH11。其余3个性状（株高、穗长和每穗实粒数）在纯合突变株系与ZH11间均存在显著或极显著差异，其中纯合突变株系CF54-6和CF54-10的株高分别为92.8和92.5 cm，较ZH11显著增加10.7%和10.4%;穗长分别为22.4和22.0 cm，较ZH11极显著增加22.4%和20.2%;每穗实粒数分别为105.8和103.4粒，较ZH11显著增加10.3%和7.8%。可见，T-DNA插入明显影响水稻植株的农艺性状。
　　3 讨论
　　水稻T-DNA插入突变体是研究基因功能的良好材料。当受体基因组中插入外源DNA片段后，可能会影响被插入的目标基因或上、下游基因的功能，也可能激活或沉默远离插入位点的基因功能（赵洁等，2013）。已有研究表明，T-DNA易插入在基因富集、转录活跃的区域，41.9%的插入位点位于基因间，25.0%的插入位点位于基因上、下游500 bp内的功能区（Chen et al.，2010）。本研究供试材料水稻T-DNA插入突变体CF54的插入位点位于Os07g44710基因下游9.94 kb和Os07g44730基因上游2.02 kb的区域，未见插入任何有注释功能的基因内部，其中，Os07g44710基因编码钙调素依赖性蛋白激酶。钙调蛋白激酶是一种调节生物细胞功能作用的蛋白质，通过与钙离子结合形成复合物后与靶酶结合，进而调控生物细胞的生长发育（胡德文等，1999）。本研究结果表明，未经生长激素处理时，纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上蜜露分泌量和虫体增重量与ZH11无显著差异，说明T-DNA插入对水稻褐飞虱抗性影响不明显，但这2个株系的穗长、每穗实粒数和株高与ZH11存在极显著或显著差异，其原因可能是T-DNA插入位点影响了钙调蛋白激酶基因的表达。但与插入位点更近的注释基因Os07g44730为未知蛋白基因，其可能参与信号通路介导的抗性反应及植物的生长发育调控。另外，由于插入位点所在的间隔区长达11.96 kb，也可能在该区段内有未知的功能基因或未知的调控序列存在。 　　前人研究表明，施用外源MeJA、SA和ET可诱导植株产生抗性，影响植食性昆虫的取食和生长发育，昆虫表现为体重下降或拒食（桂连友等，2004;龙亚芹等，2009;Lu et al.，2014）。本研究利用MeJA、SA和ET 3种外源生长激素处理ZH11及其纯合突变株系CF54-6和CF54-10后，结果发现，三者植株上褐飞虱的虫体增重量和蜜露分泌量均呈下降趋势，其中，经MeJA处理的纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱抗性较ZH11显著下降，说明3种外源生长激素均能诱导水稻野生型及其纯合突变株系植株对褐飞虱的取食与生长发育产生抑制作用，尤其是MeJA抑制效果更佳，推测这2个突变株系抗虫性受JA信号途径的影响。郭安（2009）研究也发现，水稻T-DNA右边界侧翼插入的一段281 bp DNA序列（NtTLA）后，MeJA处理可增强水稻T-DNA插入突变体中NtTIA的表达水平，推测NtTIA参与JA信号途径中的抗病防卫机制。可见，与SA和ET相比，MeJA对水稻T-DNA插入突变体CF54的褐飞虱抗性诱导作用更强，可能是T-DNA插入导致突变体植株后JA介导的信号通路被激活，外源MeJA处理产生更多防御抗虫物质的原因。因此，下一步应深入分析T-DNA插入位点两端的序列特征，检测其转录表达情况及其与JA信号途径基因的关系，探讨插入位点与抗虫性的关系。
　　4 结论
　　ET、SA和MeJA 3种外源生长激素均能诱导水稻野生型及其纯合突变株系植株对褐飞虱的取食与生长发育产生抑制作用，尤其是MeJA抑制效果最佳，推测突变株系抗虫性受茉莉酸（JA）信号途径的影响。T-DNA插入明显影响水稻植株的农艺性状。
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　　 （責任编辑 陈 燕）
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