中药龟甲HPLC指纹图谱研究

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　　摘要  目的：建立中药龟甲的HPLC指纹图谱，以达到鉴别龟甲与其混伪品的目的。方法：收集不同产地的龟甲及其混伪品21批，按上下甲进行分类，共42个样品。通过盐酸水解、脱磷、脱钙等前处理，以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯（AQC）进行衍生化反应，采用C18色谱柱（3.9 mm×150 mm，3 μm），柱温37 ℃，以乙腈，水，缓冲盐为流动相进行梯度洗脱，流速1.00 mL/min，检测波长248 nm。采用“中药指纹图谱相似度评价系统”（《中华人民共和国药典》2012版）对正品龟甲上甲与下甲、正品与常见混伪品进行相似度分析。结果：所建立的指纹图谱具有较好的精密度、重现性和稳定性。正品龟甲的上下甲相似度为0.932～0.995。正品与混伪品的相似度在0.90以下者占90.91%。结论：正品上、下甲的HPLC图谱差异较小，正品与混伪品差异较明显。所建立的HPLC指纹图谱可用于龟甲的质量评价。
　　关键词  龟甲;混伪品;HPLC指纹图谱;相似度;评价
　　 HPLC Fingerprint of Carapax et Plastrum Testudinis
　　Lyu Xiaona，Li Meng，Li Hongxia，Chen Mingyang，Xu Qing，Zhang Fan，Liu Chunsheng，Yang Yaojun
　　（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）
　　Abstract Objective： To establish HPLC （High Performance Liquid Chromatography） fingerprint of Carapax et Plastrum Testudinis by identifying tortoiseshells and their adulterants.  Methods： A total of 21 batches of tortoiseshells and their adulterants from different habitats was collected，and 42 samples were classified by the carapace and plastron. The pre-treatment of acid hydrolysis，dephosphorization and decalcification pretreatment with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate （AQC） derivatization reaction was carried out using the C18 column （3.9×150 mm，3 μm），the column temperature of 37 ℃. Acetonitrile，water，salt buffer were used as mobile phase for gradient elution at a flow rate of 1.00 mL/min and a the detection wavelength of 248 nm. The system of similarity evaluation （Pharmacopoeia 2012） was used to analyze tortoiseshells by the carapace and plastron，tortoisshells and their common adulterants.  Results： The fingerprint had good precision，reproducibility and stability. The similarity of tortoiseshells was between 0.932-0.995. The percentage was less than 90.91% under the similarity of 0.90 between tortoiseshells of their adulterants.  Conclusion： The difference of HPLC is relatively small between tortoiseshells′ carapaces and plastrons，and the difference between tortoise shells and their adulterants is obvious. The established HPLC fingerprint can be used for the quality evaluation of tortoiseshells.
　　Key Words  Carapax et Plastrum Testudinis; Adulterants; High Performance Liquid Chromatography fingerprint; Similarity evaluation
　　中圖分类号：R284.1 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.012
　　龟甲始载于《神农本草经》，列为上品[1]。2015年版《中华人民共和国药典》规定龟甲为龟科动物乌龟 Chinemys reevesii （Gray）的背甲及腹甲。其具有滋阴潜阳、益肾强骨、养血补心等功效[2]，常以龟甲饮片、醋龟甲、龟甲胶等形式入药，需求量大;且正品资源较少，价格较贵，市场上伪品与混淆品泛滥[3]。然而，龟甲的代表性成分尚不清楚，在质量控制上缺乏具有说服力的指标[3]。目前龟甲的生药学鉴别主要集中在性状和薄层鉴别上，也有部分学者尝试用比值图示法和相似系数法对其性状进行研究，并取得一定的成效。但上述研究都仅限于2个或几个龟类药材之间的比较，缺乏对龟类药材的系统性比较研究[4]。同时，龟甲的上甲与下甲是否能够统一使用，仍存在一些争议。对正品上下甲、正品与混伪品的深入研究，不仅有助于制定龟甲质量评价标准，而且对龟甲药材的市场管理有一定的指导意义。 　　HPLC适用于成分复杂而不易分离的分析对象，具有分离效能高、灵敏度高、分析速度快等优点，是目前指纹图谱技术中用途最广泛的一种方法。通过HPLC对龟甲中羟脯氨酸[5]、膠原蛋白的含量[6]，龟甲炮制品龟甲胶中14种氨基酸含量[7]等均有研究。而本实验所采用的AQC柱前衍生化HPLC也较成熟，如应用于人血浆[8]、阿胶[9]、稻米[10]等。
　　中药指纹图谱建立的目的是全面反映中药所含内在化学成分的种类和数量，进而反映其内在质量[11-12]，已应用于柑橘属中药[13]、钩藤[14]、黄芩[15]等中药的鉴别。本实验采用HPLC对不同产地的龟甲药材及其混伪品进行了指纹图谱研究，建立了正品龟甲的HPLC指纹图谱，为龟甲药材的质量控制提供有效的方法。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 药材 收集正品龟甲及其混伪品，按上下甲分为42个样品，采集地为广州、茂名、南京、无锡等地，经北京中医药大学杨瑶珺教授鉴定其品种。
　　1.1.2 药物 L-羟脯氨酸（Hyp）对照品（批号Z26M7H11979，上海源叶生物科技有限公司）;17种氨基酸标准品混合液[天冬氨酸（Asp）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、赖氨酸（Lys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe），除Cys为1.25 mmol/L外，其余均为2.5 mmol/L;批号2QL228986，Waters公司提供]。
　　1.1.3 试剂与仪器 Waters AccQ.Flour衍生化试剂盒[包含Waters AccQ.Flour缓冲液、AQC试剂粉、AQC稀释液，批号：8217860041];AccQ.Tag流动相浓缩液（乙酸盐-磷酸盐萃取剂）（批号8114160431）;乙腈（色谱纯）;盐酸;纯净水;waters高效液相色谱仪（包括2695紫外检测器，Empower数据工作站）;TCQ-250超声波清洗器（北京医疗设备二厂）;分析天平;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城仪器厂）;CS101-1C电热鼓风干燥箱（重庆四达实验仪器厂）;旋涡振荡器;中药指纹图谱相似度评价系统2012版（国家药典委员会）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 对照品溶液的制备 取浓度为2.5 mmol/L（Cys1.25 mmol/L）的17种氨基酸对照品100 μL，放入一小样品瓶中，加0.9 mL高纯水稀释，混匀，即得17种混合氨基酸对照品溶液。取Hyp适量，精密称定，加入0.1 mol/L盐酸制成0.25 mmol/L的溶液，混匀，即得羟脯氨酸对照品溶液。
　　1.2.2 供试品溶液的制备 取样品0.1 g，加入6 mol/L盐酸5 mL，充入高纯氮气30 s，密封，置于110 ℃烘箱中水解8 h，过滤，蒸干，加入20 mL 70%乙醇超声15 min，过滤，蒸干，加入0.1 mol/L草酸6 mL，超声，定容至50 mL容量瓶，用0.22 μm滤膜过滤，即得。
　　1.2.3 空白溶液的制备 在不加入样品的情况下，同供试品溶液的制备方法制备。
　　1.2.4 衍生方法 分别精密移取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液和各10 μL，置于离心管中，加入AccQ.Flour缓冲液70 μL，漩涡混合，在涡旋状态下加入AQC溶液20 μL，并保持漩涡混合10 s，密封，置55 ℃烘箱内10 min，取出，放凉，转移至微量进样瓶，即得空白、对照品和供试品的衍生化溶液。
　　1.2.5 色谱条件 色谱柱为Waters AccQ.Tag法专用C18色谱柱（3.9 mm×150 mm，3 μm），流动相A为AccQ.Tag流动相的1∶ 10稀释液，B为乙腈，C为水，按表1进行梯度洗脱，流速1.00 mL/min，紫外检测波长248 nm，柱温37 ℃，进样量10 μL。
　　2 结果
　　2.1 指纹图谱方法学考察
　　2.1.1 精密度实验 取同一供试品的衍生化溶液，连续进样6次，结果15个主要色谱峰（His、Cys、Met含量较低，未纳入计算）的相对保留时间的 RSD 均<0.68%，相对峰面积的 RSD 均<2.04%，各色谱图的相似度值不低于0.99，表明仪器等整个检测系统的精密度良好。
　　2.1.2 稳定性实验 取同一供试品的衍生化溶液，分别于0、3、6、12、24、72 h进行检测，结果15个主要色谱峰的相对保留时间的 RSD 均<0.90%，相对峰面积的 RSD 均<2.87%，各色谱峰的相似度值不低于0.97，表明供试品在室温下72 h内稳定。
　　2.1.3 重复性实验 取同一正品龟甲样品，按实验方法平行制备6份供试品溶液并衍生化，分别进样检测。结果15个主要色谱峰的相对保留时间的 RSD 均<1.0%，相对峰面积的 RSD 均小于3.0%，各色谱峰的相似度值不低于0.98，表明该方法的重复性良好。
　　2.2 中药龟甲指纹图谱的建立
　　2.2.1 各龟甲样品与其混伪品的HPLC图谱采集  在本实验色谱条件下，15种氨基酸得到有效分离。按羟脯氨酸衍生物峰计算，理论板数在4 000以上。所得空白、羟脯氨酸、17种混合氨基酸和样品的HPLC图谱见图1。
　　2.2.2 正品上甲与下甲HPLC图谱的相似度 取10批正品下甲药材，按上述试验方法制备供试品衍生化溶液，进行HPLC分析，所得图谱导入“中药指纹图谱相似度评价系统”（中华人民共和国药典2012版）进行相似度分析，其相似度为0.927～0.995，将生成的下甲对照图谱与各上甲样品进行相似度分析，结果见表2;10批正品上甲药材的相似度为0.917～0.985，上甲对照图谱与各下甲样品的相似度结果见表3。由表2可知，下甲对照图谱与各上甲样品的相似度为0.932～0.995，上甲对照图谱与各下甲样品的相似度为0.949～0.989。表明：上甲与下甲的相似度基本均在0.950以上，差异较小。因此采用龟甲上甲与下甲的HPLC图谱统一建立龟甲药材HPLC指纹图谱。 　　2.2.3 龟甲药材指纹图谱的建立 实验中，正品上甲与下甲样品均一一对应，根据上述实验结果，考虑将对应的上甲与下甲樣品合并，共10个批次。利用相似度软件，对色谱峰进行剪切、校正等处理，采用平均数法生成对照指纹图谱。见图2、表3。由表中数据可知，批次间的相似度在0.900以上的占95.56%，在0.950以上的占91.11%。各批次与所得龟甲的对照指纹图谱的相似度在0.964～0.999，显示其与对照指纹图谱有良好的相似性。
　　2.3 龟甲及其混伪品的相似度分析 将所收集的22个混伪品按试验方法制备供试品衍生化溶液，以色谱条件对其进行检测。用2.2.3项所得的对照指纹图谱与各混伪品的HPLC图谱进行相似度评价。见表4。可知相似度值在0.85以下的占81.82%;相似度值在0.90以下的占90.91%。其中地龟下甲、鹰龟下甲与正品龟甲的相似度值在0.90以上，巴西龟、黄喉拟水龟、中华花龟等品种与正品龟甲的相似度值均在0.90以下。这表明在一定程度上，龟甲药材的对照指纹图谱能够作为鉴别龟甲正伪品的参考方法之一。
　　3 讨论
　　龟甲药材中主要有效成分为蛋白质，通过蛋白质水解、AQC试剂衍生化的方法对检测氨基酸的种类和含量有较好的效果。然而，图谱中羟脯氨酸与衍生化副产物的出峰时间较接近，且色谱峰保留时间对图谱相似度有较大影响，因此，在色谱柱分离效果和仪器灵敏度良好的情况下，需严格控制流动相A稀释液的比例，而本实验采用的是1∶ 10的稀释比例。通过笔者市场走访发现，龟甲混伪品众多，而未鉴别出的地龟下甲、鹰龟下甲在性状上与正品龟甲差异较大，且目前养殖量和野生量均较少，因此对正品龟甲的鉴别影响较小。故根据龟甲对照指纹图谱及其混伪品的相似度值，可以用于鉴别正伪品龟甲，为扩大龟甲药源提供参考。
　　目前，在龟甲的药效成分尚未完全阐明的情况下，利用龟甲指纹图谱作为质量控制指标或龟甲中多种氨基酸的含量范围为指标，并结合化学模式识别如主成分分析、聚类分析以及人工神经网络等，整个评价研究将是一种更有效的质量控制方法。
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