不同产地苍耳子HPLC指纹图谱及主要成分含量测定研究

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　　摘要  目的：研究建立不同产地苍耳子的HPLC指纹图谱，并对不同产地苍耳子药材中4个主要成分进行含量测定，为制定苍耳子药材的质量标准提供参考。方法：采用高效液相色谱方法，测定了10批苍耳子药材样品，采用国家药典委员会的中药指纹图谱相似度计算软件进行数据分析，从而建立苍耳子药材的指纹图谱共有模式。 结果：从不同产地苍耳子HPLC指纹图谱中，确定了16个指纹图谱共有峰，建立了指纹图谱共有模式;测定了不同产地苍耳子中4个主要成分含量。结论：本方法稳定，重现性好，所建立的对照指纹图谱和含量限度标准可以用于不同苍耳子药材的质量评价和质量控制。
　　关键词  苍耳子药材;指纹图谱;高效液相色谱;主要成分;质量控制;含量测定;产地
　　 Study on the Fingerprint of Xanthium sibiricum L.from Different Origins and the Content Determination of Its Main Components
　　He Qin1，Zheng Wei1，Li Weidong2，Jin Junjie3，Cai Baochang2，3，Dong Zibo4，Qin Kunming3，4
　　（1 Suzhou Integrated Chinese and Western Medicine Hospital，Suzhou 215000，China; 2 College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 3 Nanjing Haiyuan Prepared Slices of Chinese Crude Drugs Co.Ltd，Nanjing 210061，China; 4 School of Pharmacy，HuaiHai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China）
　　Abstract Objective： To study the HPLC fingerprint of Fructus Xanthii，and to evaluate the quality of Fructus Xanthii from different habitats and batches，and to provide a reference for the formulation of the overall quality standard of Xanthium herbs. Methods： A total of 10 batches of Fructus Xanthii were determined by high performance liquid chromatography，and the data were analyzed by the similarity calculation software of the National Pharmacopoeia Committee of Chinese Pharmacopoeia （CTP），and the common pattern of the fingerprint of Fructus Xanthii was established. Results： A total of 16 fingerprint peaks were identified，and a common fingerprint pattern of Fructus Xanthii was established.The contents of four main components in Xanthium sibiricum from different habitats were determined. Conclusion： The method is stable and reproducible，and the established fingerprint can be used for quality evaluation and quality control of Fructus Xanthii.
　　Key Words  Fructus Xanthii herb; Fingerprint; HPLC; Main ingredients; Quality control; Content determination; Origin
　　中圖分类号：R932 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.002
　　中药苍耳子为菊科植物苍耳（ Xanthium sibiricum Patrin  ex Widder）的干燥成熟果实，临床上主要用于治疗风寒头痛、鼻渊流涕、风疹瘙痒等症。苍耳子最早记载于《神农本草经》，历代本草文献中多记载其有“有小毒”。2015版《中华人民共和国药典》将苍耳子归为“有毒”药材[1]。苍耳子所含化学成分比较复杂，主要含有酚酸类、倍半萜内酯类、水溶性苷类以及油脂类等化学成分[2]，主要药理作用有降血糖、抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等[3]。
　　目前，对苍耳子药材的质量评价主要集中在酚酸类成分以及水溶性苷类成分的含量测定研究[4-5]。酚酸类成分主要有绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C等[6];水溶性苷类主要有苍术苷和羟基苍术苷，分析方法多为高效液相色谱法或高效毛细管电泳[7]。此外，有研究采用气相色谱-质谱联用方法分析苍耳子中挥发性成分及油脂类成分[8]。
　　中药材质量与产地息息相关，不同产地的苍耳子药材是否存在质量差异尚缺乏深入研究。本实验收集了10批来自不同产区的苍耳子药材样品，采用高效液相色谱法开展指纹图谱研究，并对苍耳子中4个主要成分进行含量测定，为科学评价苍耳子药材的质量提供了参考和依据。 　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器 日本岛津公司Shimadzu LC-20AB高液相色谱仪，包括在线脱气机，自动进样器，二极管阵列检测器和柱温箱;色谱柱为YMC-Pack ODS（250×4.6 mm，5 μm）;KQ3200DB型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）;BS2242S型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）;RE-52旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。
　　1.2 试剂 甲醇（分析纯，南京化学试剂有限公司）;乙腈（色谱纯，美国天地公司）;水（去离子水，实验室自制）。绿原酸对照品购自中国药品生物制品检定所，批号：0753-200111;隐绿原酸（批号150728，纯度：98%）、异绿原酸A（批号151028，纯度：98%）、异绿原酸C（批号150624，纯度：98%）均购自南京世洲生物科技有限公司，质量分数采用面积归一化法测定均≥98%。
　　1.3 分析样品 本品由南京海源中药饮片有限公司从河北安国中药材市场采购，经丁斐执业药师鉴定为菊科植物苍耳（ Xanthium sibiricum Patrin  ex Widder）的成熟带总苞的果實，共10批，产地和批号见表1。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件 流动相：乙腈（B）-0.4%磷酸水溶液（A）;柱温：35 ℃;检测波长：320 nm;流速：1 mL/min;进样体积：10 μL;梯度洗脱程序：0～35 min，10%B→17% B;35～40 min，17%B→20%B;40～55 min，20%B→30%B;55～70 min，30%B→60%B;70～75 min，60%B→10%B。
　　2.2 对照品溶液的制备 取绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C对照品各10 mg，精密称定，分别置5 mL容量瓶中，用20%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得对照品储备液。取上述对照品储备液适量，置于同一10 mL棕色容量瓶中，加20%乙醇稀释至刻度，得混合对照品溶液。
　　2.3 样品溶液的制备 取上述不同产地的苍耳子药材，粉碎后过60目筛。取苍耳子药材粉末1 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，加甲醇30 mL，称重。超声处理60 min，放冷后称重，用甲醇补足减失重量，滤纸过滤，滤液减压浓缩，浓缩液加甲醇定容至10 mL，用0.45 μm有机滤膜滤过，即得样品溶液。
　　2.4 不同产地苍耳子指纹图谱建立
　　2.4.1 精密度试验 取同一样品溶液，照上述色谱条件，连续进样6次，记录色谱图中各主要色谱峰的保留时间和峰面积，各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积值的 RSD 值分别在0.00% ～0.15%和0.13% ～2.19%之间，表明仪器的精密度良好。
　　2.4.2 重复性试验 取1号苍耳子样品，按2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，照上述色谱条件，分别进样分析，记录色谱图中各主要色谱峰的保留时间和峰面积。各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积值的 RSD 值分别在0.00% ～1.08%和1.22% ～2.37%之间，表明该分析方法重复性良好。
　　2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，照上述色谱条件，分别在0，2，4，6，8，24 h进样分析，记录色谱图中各主要色谱峰的保留时间和峰面积。各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积值的 RSD 值分别在0.00% ～1.30%和1.26% ～3.09%之间，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
　　2.4.4 指纹图谱建立及共有峰标定 按上述方法测定10批苍耳子药材的指纹图谱，采用中华人民共和国药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件，自动匹配10批次苍耳子的HPLC色谱图色谱峰保留时间和峰面积等参数，以平均数法作为对照指纹图谱的生成方法，建立苍耳子药材的指纹图谱共有模式，生成对照指纹图谱。10批苍耳子药材的指纹图谱叠加图。见图1。指纹图谱共有模式。见图2。
　　 通过分析，确定了苍耳子药材指纹图谱中16个共有峰，其中13号峰的峰面积较大，且分离度和峰形都较好，因此我们选择13号峰作为参照物峰，标号为S，其他特征峰依次标号为1，2，……，S，……，16。根据指纹图谱相似度评价结果，得出样品的相似度，10批苍耳子药材样品的相似度计算数据。见表2。来自河南、河北、山东、江苏等中东部地区的6批苍耳子指纹图谱相似度均在0.8以上，来自四川、广东、黑龙江和辽宁的苍耳子指纹图谱相似度与中东部产区相比较低，但这4个产地间样品指纹图谱相似度均达到0.8以上，相似度较高。 由此可见，不同产地苍耳子药材内在质量存在一定差异;地理位置靠近的中东部省区产苍耳子质量相近;东北和南方产的苍耳子内在质量相似度较高，其内在成分累积规律还有待进一步深入研究。
　　2.4.5 共有峰的相对保留时间及相对峰面积 通过与对照品保留时间和紫外光谱检测的结果进行比较，图2中峰7为绿原酸，峰8为隐绿原酸，峰13为异绿原酸A，峰15为异绿原酸C。异绿原酸A含量较高，且位于色谱图中间位置，因此选为参照物峰。将共有指纹峰的保留时间和峰面积与13号峰的保留时间和峰面积比较，对苍耳子药材共有模式中已标定的16个共有峰进行比值计算。10批苍耳子药材样品的指纹图谱共有峰相对保留时间及相对峰面积值数据。见表3、表4。
　　2.5 不同产地苍耳子中4个主要成分含量测定
　　2.5.1 线性关系考察 精密量取适量的混合对照品溶液于容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成系列标准溶液，在2.1项色谱条件下分别进样20 μL测定，以对照品溶液的质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算4个成分的线性回归方程为：绿原酸Y=9 950 320.42X+4 769.84（r=0.999 6）、隐绿原酸Y=68 921 037.01X+51 960.39（r=0.999 8）、异绿原酸AY=8 210 383.75X+1 952.74（r=0.999 9）、异绿原酸CY=1 629 357.81X+4 819.16（r=0.999 8），结果表明上述4个成分在浓度为0.012 5～0.250 mg/mL之间呈良好的线性关系。 　　2.5.2 精密度试验 取1号苍耳子样品供试品溶液20 μL，在2.1项色谱条件下连续进样6次，4个成分含量的 RSD 均小于0.25%，结果表明仪器精密度良好。
　　2.5.3 稳定性试验 取1号苍耳子样品供试品溶液，分别在配制后的0，4，8，12，16，24 h进样测定，测得4个成分含量的 RSD 均小于0.20%，说明供试样品在24 h内稳定。
　　2.5.4 重复性试验 取1号苍耳子样品，按2.3项下供试品溶液的制备方法操作，平行制备6份供试品溶液，在2.1项色谱条件下分别进样分析，测得4个成分含量的 RSD 均小于3.50%，结果表明该方法的重复性良好。
　　2.5.5 回收率试验 精密称取已知含量的1号苍耳子样品粉末6份，每份0.5 g，分别精密加入相当于药材中4个成分含量的对照品溶液，混匀，按2.2项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别按2.1项下色谱条件进行测定。结果显示：4个成分的平均回收率为97.87%， RSD 为2.71%。
　　2.5.6 样品测定结果 分别精密称取不同产地苍耳子样品适量，按2.3项下供试液品制备方法分别制备成供试品溶液，依照2.1项下色谱条件分析各样品。各供试品溶液分别进样测定3次，以峰面积按标准曲线法计算各样品中4个主要成分的含量，并计算平均值。不同产地苍耳子中4个成分的含量差异较大，原因可能为4个酚酸类成分含量受苍耳子的品种、产地和采收期影响较大。 在苍耳子质量控制中应该对绿原酸隐绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C等酚酸类成分进行质量控制，以全面评价苍耳子药材质量。由于现有数据显示，不同产地苍耳子内在质量差异较大，因此为了建立更加科学合理的质量标准，还需要通过大样本的数据比较分析。由此可见，在整体特征图谱相似性良好的情况下，饮片所含有效成分的含量仍然可能存在较大差异。因此有必要在特征图谱评价基础上增加指标性成分的含量测定，从而全面评价中药饮片的质量。见表5。
　　3 讨论
　　苍耳子药材中含有多类不同的化学成分，如酚酸类、倍半萜内酯类和水溶性苷类等[9]，为了尽可能多的提取主要代表性成分，本研究选用甲醇和乙醇2种不同溶剂进行比较研究，并且考察了超声提取法和加热回流提取法对苍耳子药材提取效率的影响，结果显示：苍耳子药材用甲醇超声提取效果最佳。通过上述研究，最终建立了苍耳子药材的提取方法，可以尽可能多的提取主要成分，用于进行指纹图谱研究，确保建立的指纹图谱共有模式更有代表性。
　　在指纹图谱分析方法的建立过程中，先后选用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.4%磷酸水等作流动相，结果显示：采用乙腈-0.4%磷酸水作为流动相，进行梯度洗脱时，色谱图基线较为稳定，峰形较好，分离度符合要求。通过DAD全波长扫描，结果显示320 nm处色谱峰出峰最多，且分离度良好，故最终选择检测波长为320 nm。
　　研究结果表明，特征图谱技术可以有效进行中药饮片的鉴别，但是在整体图谱相似性良好的情况下，药材所含有效成分的含量仍然可能存在较大差异，如不同产地苍耳子中的4个主要成分含量各不相同。因此有必要在特征图谱评价基础上尽增加有效成分的含量测定，从而全面评价中药饮片的质量，建立更加全面、科学、合理的中药饮片质量评价体系。
　　参考文献
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